Способ автоматизированного определения концентрации активного лизоцима в биологических образцах Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/02 C12N9/36 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, в частности, к иммунологии, лабораторной диагностике, к биотехнологии и фармакологии, может быть использовано для оценки неспецифического антимикробного местного иммунного ответа в ротовой полости и других биологических жидкостях биотопов организма человека и касается способа определения концентрации активного лизоцима в различных биологических образцах, включая медицинские иммунобиологические препараты.

Лизоцим - это термостабильный фермент мурамидаза, который разрушает клеточную стенку преимущественно грамположительных бактерий, гидролизуя β-гликозидные связи между аминосахарами пептидогликана, в результате чего происходит лизис бактериальных клеток. Лизоцим содержится во всех тканевых жидкостях, в клетках крови (макрофагах, лейкоцитах и других). В качестве модельного микроорганизма для определения активного лизоцима обычно используется бактерия Micrococcus lysodeicticus. (ML).

Самым чувствительным методом определения концентрации лизоцима является иммуноферментный анализ (ИФА) (Ищенко У.В., Юпатова Т.Г., 2017). Однако, при использовании иммуноферментного метода лизоцим определяется только как антиген и не оценивается его концентрация как активного фермента, что необходимо, например, для биотехнологических целей. Кроме того, из-за большой чувствительности ИФА в соответствующих коммерческих тест-системах используется неудобный для клинической и биотехнологической практики диапазон концентраций. Например, в наборе фирмы Assaypro LLC этот диапазон составляет от 0 до 5 нг/мл. В имеющихся лизоцим-содержащих лечебных препаратах и биологических жидкостях человека концентрация лизоцима по крайней мере на 3 порядка больше. Соответственно, требуются разведения исследуемых образцов в 1000, 10000 и даже в 1000000 раз, что вносит очень большую ошибку при расчете конечной концентрации лизоцима.

В настоящее время известно много разнообразных способов определения активности лизоцима в биологических средах, основанных на его способности лизировать тестовую культуру ML. Большое число авторов использует трудоемкие методики, связанные с выращиванием культуры ML, что само по себе является длительным процессом (от 10 до 48 часов). При этом суточная культура бактерий необходима при каждой постановке.

Во многих методиках активность лизоцима определяется полуколичественно, в неких единицах активности, в % от начальной оптической плотности, что также неудобно для клинических и биотехнологических целей. В связи с этим актуальна разработка простого, быстрого, чувствительного и воспроизводимого метода количественного определения активности лизоцима.

Широко известен нефелометрический метод определения активности лизоцима по Дорофейчуку (Дорофейчук В.Г., 1968). При постановке этого метода готовят суспензию из суточной культуры ML в фосфатном буфере (ФБ), рН 7,2-7,4, со светопропусканием 20%, что соответствует оптической плотности (OD) 0,70 при длине волны 540 нм. В пробирку с 1,47 мл стандартизированной тест-культуры добавляют 0,03 мл сыворотки крови, получая таким образом разведение 1:50. Полученную смесь встряхивают и инкубируют при +37°С в течение 1 ч, после чего измеряют OD. Активность лизоцима определяют по разности OD стандартизированной культуры ML и ее смеси с сывороткой крови после инкубации.

Недостатками этого метода являются выращивание суточной культуры микроорганизма для каждой постановки, длительное время проведения ферментативной реакции, что является фактором, искажающим результат, и отсутствие системы расчета.

Известен «Способ определения активности лизоцима в биологической среде» (патент BY №22808), в котором выращивают культуру ML на мясопептонном агаре, выделяют из нее пептидогликан, метят его 2%-ным раствором Конго красного. Затем готовят опытную и контрольную пробы: 1) контрольная проба содержит фосфатный буферный раствор, физиологический раствор и биологическую среду; 2) опытная проба содержит фосфатный буферный раствор, пептидогликан, меченный Конго красным, и биологическую среду. Далее обе пробы инкубируют в термостате при +37°С в течение 24 часов, затем центрифугируют, из надосадка отбирают в дублях по 150 мкл пробы, которые переносят в лунки 96-луночного полистиролового планшета и определяют оптическую плотность в лунках на спектрофотометре при длине волны 492 нм. Промежуточный результат рассчитывают как разность оптических плотностей опытных и контрольных проб, для пересчета результата в мкг/мл используют формулу, полученную путем построения калибровочной кривой с разведенным лизоцимом, где отражена зависимость активности лизоцима от оптической плотности раствора Конго красного. Достоинством метода является однократное приготовление субстрата (пептидогликан, меченный Конго красным), возможность его хранения при температуре -20°С и использования на протяжении длительного времени.

Недостатком метода является очень длительное и трудоемкое приготовление субстрата (выращивание суточной культуры ML при +37°С, отмывка физраствором, центрифугирование, убивка бактерий нагретым до +90°С 30%-ным водным раствором фенола, отмывка, центрифугирование, удаление следовых количеств липополисахарида с помощью уксусной кислоты при температуре +100°С, охлаждение, центрифугирование, промывка, диализ в течение 3-х суток с ежесуточным удалением диализата и заменой буферного раствора, разбивка суспензии пептидогликана ультразвуком, отмывка, обработка ферментом ДНК-азой для очистки от частиц ДНК, отмывка, мечение суспензии Конго красным, отмывка). Другими серьезными недостатками являются необходимость большого количества реактивов и редкого оборудования, а также отсутствие количественного определения лизоцима. Также необходима оценка качества полученного пептидогликана, которая проводится методом конфокальной микроскопии в препарате «висячая капля» путем немедленного послойного сканирования на конфокальном микроскопе. Диаметр частиц должен соответствовать размеру 2-9 мкм.

Известен также «Способ определения лизоцимной активности биологических объектов» (патент RU 2294373 С2), выполнение которого проходит в несколько этапов.

На первом этапе тест-культуру ML, штамм 2665 ГИСК им. Тарасевича, выращивают на жидкой питательной среде при оптимальной температуре роста +27°С до оптической плотности 3,2-3,4, примерно до 11-го часа роста, что соответствует фазе логарифмического роста микроорганизма (6-13 часов), таким образом происходит стандартизация фазы роста микроорганизма, затем суспензию лиофильно высушивают и хранят при температуре (+4°С)-(+12°С).

На втором этапе лиофилизированную тест-культуру стандартизируют в 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,0, на спектрофотометре при длине волны 540 нм до оптической плотности 0,6-0,62.

На третьем этапе для определения лизоцимной активности исследуемых объектов в стандартизированную суспензию вносят раствор исследуемого образца и сразу же измеряют начальную оптическую плотность. Затем инкубируют смесь 30 мин. при +37°С и измеряют конечную оптическую плотность при длине волны 540 нм. Изменение оптической плотности вычисляют по формуле: Δ OD = OD нач. - OD конеч.

Параллельно с опытом ставится контроль: стандартизированная суспензия и фосфатный буферный раствор вместо исследуемого образца.

На четвертом этапе проводят определение содержания белка в исследуемых объектах по методу Лоури.

На пятом этапе вычисляют удельную лизоцимную активность (у. ед. а.). За единицу лизоцимной активности (ед. а.) исследуемого образца принимают такое его количество, которое вызывает снижение величины начальной оптической плотности стандартизированной суспензии клеток ML на 0,001 за 1 минуту по формуле:

ед. а. = ΔOD/0,001 х t, где ΔOD - изменение оптической плотности, t - время инкубирования в минутах.

Удельную лизоцимную активность рассчитывают по формуле:

у. ед. а. = ед. а. /[С] х 0,001 х t, где [С] - концентрация белка в исследуемом объекте.

Использование стандартизированной лиофилизированной тест-культуры ML дает более точные, достоверные и сопоставимые сведения об уровне лизоцимной активности исследуемых биологических объектов по сравнению с ацетонированной тест-культурой ML, штамм №2665 ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Недостатки метода: трудоемкая и длительная методика, отсутствие количественного определения лизоцима.

Известен «Способ определения активности лизоцима в ротовой жидкости» (патент RU2786802 С1). Способ заключается в том, что готовят культуру ML (ГИСК им. Л.А. Тарасевича) в концентрации 10 млрд клеток/мл, далее в пробирку к ротовой жидкости объемом 1 мл вносят 3 мл 1% физиологического раствора и 1 мл приготовленной суспензии ML. Полученную смесь тщательно перемешивают и измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора (OD0), затем смесь термостатируют при +37°С в течение 2,5 часов и повторно измеряют оптическую плотность (OD1). Вычисление активности лизоцима (L) авторы проводят по формуле: L=(OD0-OD1)/OD0 х 100%. Чем выше показатель L, тем хуже иммунологический статус.Способ позволяет определять состояние иммунного статуса в ротовой полости при наличии заболеваний на ранних этапах.

Недостатки способа: большой расход реагентов, относительно большая длительность эксперимента и главное - отсутствие количественного определения лизоцима.

Известен «Способ определения активности лизоцима слюны» (патент RU 2170932 С1). Методика заключается в следующем: в течение 24 часов выращивают агаровую культуру ML (штамм №2665 ГИСК им. Л.А. Тарасевича), затем бактериальные клетки убивают хлороформом, отмывают, центрифугируют, стандартизируют на спектрофотометре при длине волны 540 нм до оптической плотности 0,300, готовят смесь слюны, разведенной в 15 раз, и стандартизированной суспензии ML. Сразу же определяют начальную оптическую плотность смеси (OD нач.), затем смесь термостатируют при+37°С 10 мин и снова измеряют оптическую плотность (OD конеч.). Активность лизоцима (АЛ) вычисляют по специальной, выведенной авторами на основе математических расчетов, формуле: АЛ = (OD нач. - OD конеч.) х 200, где 200 - коэффициент пересчета. Затем определяют удельную активность лизоцима по формуле, выведенной многократными исследованиями авторов. За единицу лизоцима условно принимают количество фермента, способного лизировать липополисахариды ML, содержащие 0,001 мг белка: АЛ = (OD нач. - OD конеч.) х k х 10x2 / 10 ед/мл/мин, где k - коэффициент пересчета = 100, 10 - разведение слюны, 2 - пересчет на 1 мл, 10 - время инкубации.

Недостатки метода: необходимость суточной культуры бактерий ML для каждой постановки, отсутствие количественного определения лизоцима, эмпирические коэффициенты пересчета в формулах, предложенных авторами.

Существуют нефелометрические методы определения лизоцима, основанные также на его способности лизировать ML (например: J. Borgen and I. Romslo., 1977). В методе используются лиофилизированные клетки ML и лизоцим (оба препарата - Sigma Chemical Co.), нефелометр Coleman Model 91 Amylase Lipase Analyzer. Эксперимент выполнялся при +37°C, смесь состояла из 2,5 мл 0,066 М фосфатного буферного раствора, рН 6,2, 0,9 мг ML и 50 мкл образца, содержащего либо калибратор (лизоцим в концентрациях 50 мкг/мл и меньше), либо клинический образец крови или мочи. Время инкубации составляло 3 мин. Снижение рассеяния линейно зависело от количества внесенного лизоцима (при концентрациях ниже 50 мг/л). Этот же эксперимент был повторен с фотометрической фиксацией результатов. Полученные данные при нефелометрическом определении согласовывались с данными, полученными при фотометрическом определении просветления суспензии ML. Активность в клинических образцах выражали в единицах концентрации, т.к. сравнивали результаты в клинических образцах крови или мочи с результатами, полученными со стандартом - лизоцимом, обладающим специфической активностью.

Недостатком метода можно назвать большой расход ML и отсутствие автоматического измерения результата реакции, что приводит к увеличению погрешности измерения и не позволяет провести большое количество анализов единовременно.

Существуют и другие описанные в литературе методы анализа активности лизоцима, основанные на его способности лизировать клеточные стенки ML. Результаты, полученные нефелометрическим, спектрофотометрическим и лизопланшетным методами, хорошо коррелируют между собой по концентрациям лизоцима (S. Reitamo, М. Lalla & А. Huipero, 1981).

Наиболее близким методом количественного определения активного лизоцима является спектрофотометрический метод, предложенный D. Ronen, Е. Eylan, A. Romano, R. Stein & М. Modan (1975). Количество активного лизоцима определяли в специально собранных образцах слез по снижению OD суспензии ML, вызванной лизоцимом, измеренной на спектрофотометре при длине волны 450 нм. Субстратом была суспензия 0,71 мг лиофилизированного из замороженного состояния ML в 3 мл 0,15 М фосфатного буферного раствора, рН 6,24. OD суспензии находилась в диапазоне от 1,0 до 1,2, измерение проводили при комнатной температуре. Такой стандартизированный субстрат готовили перед каждым измерением. 25 мкл тестируемого раствора/образца быстро добавляли к стандартизированной суспензии, перемешивали и измеряли оптическую плотность через 2 мин. Такой временной интервал оказался оптимальным. Стандартную кривую активности лизоцима строили с использованием весового стандарта лизоцима из куриного яйца, концентрацию лизоцима выражали в мг/мл. Образцы слез ставили неразведенными и разведенными в 10 и 50 раз, причем наблюдалось увеличение конечной концентрации лизоцима при увеличении фактора разведения. Авторы объяснили этот эффект тем, что при разведении слез уменьшается количество ингибиторов лизоцима, т.е. активность ингибиторов падает, а активность фермента увеличивается. Другой возможной причиной авторы посчитали то, что димерная форма лизоцима, не обладающая ферментативной активностью и присутствующая в значительных количествах первоначально, изменялась до мономерной активной формы при разведении. Наиболее удобным для рутинной практики авторы приняли разведение образцов в 10 раз. Концентрацию активного лизоцима в образцах слез определяли по стандартной кривой. Концентрация лизоцима в образце соответствовала таковой в стандарте, вызывающей такое же снижение OD. Диапазон концентраций лизоцима на линейном участке стандартной кривой в условиях опыта был от 50 мкг/мл до 2 мг/мл. Метод показал высокую чувствительность.

Данный способ принят за прототип.

Недостатком этого метода является необходимость при каждом эксперименте для каждого отдельного образца взвешивать и стандартизировать лиофилизированный порошок ML, что приводит к его неэкономичному расходу, а также неавтоматизированные проведение эксперимента, измерение и расчет результата реакции.

Описанные методы имеют недостатки: трудоемкость и длительность выполнения, отсутствие автоматизированного проведения эксперимента и учета результатов либо получение результата в полуколичественном виде, что заставляют искать более простой, точный, быстрый, экономичный, чувствительный количественный метод определения активности лизоцима, пригодный как для анализа биологических жидкостей в клинической практике, так и в биотехнологии.

Технической проблемой изобретения является разработка способа определения концентрации активного лизоцима в биологических образцах, при котором возможны одновременная постановка на одном планшете большого количества образцов разного характера (до 78 образцов) в одном эксперименте (например, биологические жидкости или лечебные и биотехнологические препараты), возможность количественно определять концентрацию активного лизоцима и проводить автоматизированный учет результатов.

Поставленная задача решается за счет того, что ферментативная активность неизвестного биологического (слюна и т.п.) или биотехнологического (коммерческий лизоцим-содержащий препарат) образца сравнивается со стандартным образцом с весовой концентрацией лизоцима; при этом определяется активный лизоцим, т.е. лизоцим, имеющий специфическую ферментативную активность - лизис бактериальной стенки ML, что приводит к уменьшение OD реакционной смеси.

Техническим результатом заявляемого изобретения является:

- одновременная постановка до 78 образцов разного характера в одном эксперименте (например, биологические жидкости или лечебные и биотехнологические препараты);

- возможность количественно определять концентрацию активного лизоцима и проводить автоматизированный учет результатов, что позволяет избежать многих ошибок и получить достоверные и сопоставимые результаты по концентрации активного лизоцима в иммунобиологических препаратах, а также в биологических жидкостях человека в норме и при патологических состояниях для определения эффективности лечения;

- использование любого планшетного фотометра с программным обеспечением;

- небольшое время проведения реакции;

- малые затраты реагентов;

- легкость стандартизации субстрата реакции;

- подбор температуры проведения реакции +25°С с целью исключения самопроизвольного лизиса бактериальной клетки Micrococcus lysodeicticus (ML)

В заявляемом методе предлагается выражать активность лизоцима в единицах концентрации (мкг/мл, мг/л), т.к. сравнивается ферментативная активность неизвестного биологического (слюна и т.п.) или биотехнологического (коммерческий лизоцим-содержащий препарат) образца со стандартным образцом с весовой концентрацией лизоцима, при этом определяется активный лизоцим, т.е. лизоцим, имеющий специфическую ферментативную активность - лизис бактериальной стенки ML, что приводит к уменьшение OD реакционной смеси.

Важнейшим отличием предлагаемого способа определения концентрации активного лизоцима является температура проведения реакции +25°С. Как показано Соловых Г.Н. с соавторами (патент RU 2294373), выращивание культуры ML (штамм №2665 ГИСК им. Л.А. Тарасевича) при +37°С не является оптимальным, т.к. происходит достаточно быстрый самопроизвольный лизис клеток микрококка и, следовательно, такой ML не может быть использован в эксперименте по определению уровня лизоцимной активности. Этими авторами предложена оптимальная температура для выращивания микрококка, равная+27°С.Эта же температура +27°С предложена Дж. Хоултом (1997). Кроме того, в соответствии с общими правилами работы с ферментами рекомендуется, где это возможно, придерживаться температуры +25°С, т.к. она является стандартной в физической химии (М. Диксон, Э. Уэбб. 1982). При разработке предлагаемого метода были опробованы разные температурные условия проведения реакции, в т.ч. +37°С. Была выбрана температура +25°С, т.к. при ней гарантированно получался длинный линейный участок калибровочной кривой. После инкубации реакционной смеси при +37°С достаточно часто наблюдался прогиб кривой уже при концентрации активного лизоцима 25-30 мкг/мл, что приводило к недостоверным результатам. Виды калибровочной кривой при инкубации в различных температурных режимах представлены на Фигурах 1 и 2.

Также важным является использование стандартизированной суспензии ML во временном диапазоне, не превышающем 1 час после самого процесса стандартизации, т.к. после этого времени могут происходить неконтролируемые процессы лизиса или размножения или агрегации микробных клеток ML, что может привести к изменениям OD реакционной смеси, зависящим не только от ферментативной активности лизоцима.

В заявляемом способе определения концентрации активного лизоцима исследуемыми образцами могут быть различные биологические жидкости (например, слюна, слеза, кровь, моча, женское молоко и др.) и лечебные препараты, содержащие в своем составе лизоцим.

Перед проведением эксперимента исследуемые образцы необходимо подготовить: если необходимо - развести в 0,1 М ФБ, рН 6,5-6,6 либо оставить неразведенными, либо сконцентрировать, чтобы попасть в диапазон концентраций калибровочной кривой 0-40 мкг/мл, а предпочтительно в ее центральную часть (10-20 мкг/мл).

Протокол проведения анализа по определению концентрации активного лизоцима. Подготовка к проведению реакции.

1. Включают планшетный термошейкер и устанавливают температуру +25°С.

2. Из предварительно приготовленного маточного раствора лизоцима готовят стандартные образцы лизоцима.

3. Подготавливают исследуемые образцы (размораживают, готовят разведения, если необходимо).

4. Оформляют схему анализа и из нее рассчитывают необходимые объемы суспензии ML.

5. Включают планшетный фотометр.

6. Настраивают компьютерную программу в фотометре в соответствии со схемой.

7. Готовят суспензию ML.

Приготовление стандартных (калибровочных) образцов лизоцима (СОЛ).

В качестве стандартного препарата используют коммерческий препарат лизоцима из куриного яйца производства компании ДиаМ. Можно использовать и другие препараты лизоцима.

Первоначально готовят маточный раствор лизоцима. Для этого навеску лизоцима растворяют в 0,1 М ФБ, рН 6,5-6,6, до конечной концентрации 1 мг/мл. Приготовленный маточный раствор лизоцима разливают на аликвоты для однократного размораживания и хранят при температуре (-20°С)-(-35°С) до анализа.

Стандартные (калибровочные) образцы лизоцима (СОЛ) - 0, 5,10,20, 30,40 мкг/мл - готовят непосредственно перед проведением анализа из маточного раствора лизоцима -

(1 мг/мл). Для каждой точки калибровки в триплете необходимо по 150 мкл раствора СОЛ каждой концентрации, следовательно, для удобства внесения готовят не менее 200 мкл раствора каждой концентрации:

1) разведение в 25 раз: 25 мкл маточного раствора лизоцима (1 мг/мл) + 600 мкл ФБ = 625 мкл с концентрацией лизоцима 40 мкг/мл;

2) далее методом двукратных разведений каждого предыдущего раствора в ФБ, рН 6,5-6,6, готовят еще 3 стандартных образца с концентрациями лизоцима 20 мкг/мл, 10 мкг/мл и 5 мкг/мл. Из образца с концентрацией 40 мкг/мл отбирают 200 мкл+200 мкл ФБ, рН 6,5-6,6, и т.д.;

3) стандартный образец лизоцима с концентрацией 30 мкг/мл готовят отдельно из образца с концентрацией 40 мкг/мл: 150 мкл + 50 мкл ФБ, рН 6,5-6,6. В качестве стандартного образца, не содержащего лизоцим («нулевая точка», 0 мкг/мл лизоцима), используют 0,1 М ФБ, рН 6,5-6,6.

Подготовка исследуемых образцов.

Сбор образцов слюны для клинических целей проводят утром натощак в центрифужную пробирку в течение 10 минут. Дальше в течение 2-х часов слюна должна быть доставлена в лабораторию, где ее центрифугируют, отбирают надосадок и подвергают его анализу на активный лизоцим. При необходимости полученный надосадок разливают на аликвоты по 200 мкл и хранят при температуре (-20°С)-(-35°С) до анализа.

Подготовку образцов сыворотки крови проводят следующим образом: кровь берут из локтевой вены, выдерживают 20 мин при комнатной температуре до образования сгустка, отделяют сыворотку центрифугированием и подвергают ее анализу на активный лизоцим. При необходимости полученную сыворотку крови разливают на аликвоты по 200 мкл и хранят при температуре (-20°С)-(-35°С) до анализа.

Лизоцим-содержащие препараты переводят в жидкую форму, используя 0,1 М ФБ, рН 6,5-6,6: в эксперименте удобно использовать раствор с предполагаемой начальной концентрацией лизоцима 5 мг/мл. При необходимости полученный раствор разливают на аликвоты и хранят при температуре (-20°С)-(-35°С) до анализа.

Приготовление суспензии ML.

В качестве субстрата в заявляемом способе используют лиофилизированный коммерческий препарат ML производства фирмы Sigma. Можно использовать и другие подобные препараты, в т.ч. ML штамм №2665 ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Готовят стандартизированную суспензию ML: навеску ML, примерно 10 мг, растворяют в 14 мл 0,1 М ФБ, рН 6,5-6,6, хорошо перемешивают. Полученную суспензию стандартизируют по OD при длине волны 450 нм, для чего в лунку плоскодонного полистиролового планшета вносят 150 мкл суспензии ML и 50 мкл 0,1 М ФБ, рН 6,5-6,6, встряхивают и измеряют OD на планшетном фотометре при длине волны 450 нм. OD стандартизованной суспензии должна составлять 0,550-0,700. Если светопропускание больше - необходимо добавить буфер, если меньше - лиофилизированный порошок ML. На полный 96-луночный планшет требуется 14,4 мл стандартизированной суспензии ML. Стандартизированную суспензию ML до проведения реакции держат в холодильнике при (+4°С)-(+8°С) не более 1 ч.

Проведение реакции

1. Внесение образцов в планшет проводят при комнатной температуре от +18°С до +25°С. Если необходимо, то в помещении регулируют температуру с помощью кондиционера. Температура в течение всего эксперимента в термошейкере, где будет проходить реакция, контролируется автоматически и поддерживается на уровне +25°С.

2. В лунки охлаждаемого 96-луночного плоскодонного полистиролового разборного планшета вносят в триплете по 50 мкл стандартные образцы лизоцима (в качестве образца, не содержащего лизоцим - «нулевая точка» - используют 0,1 М ФБ, рН 6,5-6,6), исследуемые образцы согласно схеме анализа, планшет при этом помещен на хладоэлемент.

3. Перед внесением ML планшет с внесенными образцами выдерживают 6 мин в холодильнике без хладоэлемента.

4. Во все лунки планшета вносят по 150 мкл стандартизированной суспензии ML, планшет при этом помещен на хладоэлемент. Внимание: важно быстро произвести внесение.

5. Планшет инкубируют 6 мин в термошейкере при +25°С и встряхивании 100 об/мин.

6. После инкубации сразу измеряют OD при длине волны 450 нм на планшетном фотометре (программа со встряхиванием 3 сек).

7. Расчет результатов проводят по автоматически построенной калибровочной кривой с использованием компьютерной программы, где по оси ординат - оптическая плотность, по оси абсцисс - концентрация лизоцима в мкг/мл (+25°С). (Фиг 1).

Для сравнения на Фиг. 2 показана калибровочная кривая, полученная при инкубации планшета в термошейкере при +37°С, все остальные условия - те же.

Примеры осуществления изобретения

Пример 1. Определение концентрации активного лизоцима в слюне.

Подготовка образцов слюны

Определение концентрации активного лизоцима проведено в 4 образцах слюны, хранившихся при (-35°С) и однократно размороженных непосредственно перед проведением анализа. Образцы №№1, 2, 3 ставили неразведенными, образец слюны №4 развели в 0,1М ФБ, рН 6,5-6,6 в 4 и 8 раз (1:3 и 1:7, соответственно). Приведены результаты 2-х экспериментов.

Схема анализа.

Результаты.

Концентрация активного лизоцима в образцах слюны - эксперимент 1.

Концентрация активного лизоцима в образцах слюны - эксперимент 2.

Результаты определения концентрации активного лизоцима в слюне, полученные в разных экспериментах, отличались не более, чем на 9%, в том числе для образца слюны №4 с учетом разведения.

Пример 2. Определение концентрации активного лизоцима в коммерческом препарате «Лизобакт» (ЛБ).

Определение концентрации активного лизоцима проведено в 3 сериях коммерческого препарата «Лизобакт» (таблетки для рассасывания, серии 4851, 4925, 5028). Приведены результаты 2-х экспериментов.

Приготовление исследуемых образцов ЛБ.

Согласно данным об ожидаемой концентрации лизоцима в коммерческом препарате «Лизобакт» (по данным производителя 1 таблетка содержит 20 мг лизоцима гидрохлорида), предварительно таблетки ЛБ растирали в ступке, растворяли в 0,1 М ФБ, рН 6,5-6,6, из расчета 4 мл/таблетка и центрифугировали полученную суспензию при 20000 об/мин в течение 20 мин на центрифуге с охлаждением. Анализировали надосадочную жидкость (исходный препарат ЛБ) с предполагаемой концентрацией лизоцима 5 мг/мл.

Из исходного препарата ЛБ готовили разведения 1:250 и 1:500. Для внесения в одну лунку необходимо 50 мкл пробы. Для удобства внесения в планшет в триплете готовили по 250 мкл раствора каждой концентрации:

1) разведение в 5 раз: 100 мкл раствора ЛБ (5 мг/мл) + 400 мкл ФБ, рН 6,5-6,6=500 мкл с предполагаемой концентрацией лизоцима 1 мг/мл; 2) разведение полученных проб в 25 раз: 40 мкл препарата в первом разведении (1 мг/мл) + 960 мкл ФБ, рН 6,5-6,6=1000 мкл раствора, таким образом получают разведение исходного препарата ЛБ 1:125; 3) затем методом двукратных разведений (250 мкл пробы и 250 мкл ФБ, рН 6,5-6,6) готовили необходимые разведения 1:250 и 1:500. Эти 2 разведения использовали в эксперименте, т.к. ожидаемые концентрации лизоцима в них составляют 20 мкг/мл и 10 мкг/мл, соответственно, и таким образом они попадают на центральный участок калибровочной кривой.

Схема анализа.

Результаты.

Концентрация активного лизоцима в препарате «Лизобакт» - эксперимент 1.

Средняя концентрация лизоцима в сериях Лизобакта - 5,55 мг/мл. Концентрация активного лизоцима в препарате «Лизобакт» - эксперимент 2.

Средняя концентрация лизоцима в сериях Лизобакта - 5,66 мг/мл.

Результаты определения концентрации активного лизоцима в коммерческом препарате «Лизобакт», полученные в разных экспериментах, отличались не более, чем на 12%, в том числе с учетом разведения образцов и из серии в серию.

Пример 3. Определение концентрации активного лизоцима в экспериментальном модельном образце, содержащем 100 мкг/мл лизоцима.

Приготовление экспериментального модельного образца, содержащего лизоцим.

Экспериментальный образец готовили из раствора иммуноглобулинов человека, в который внесли навеску лизоцима (ИГ+Л) до конечной концентрации 100 мкг/мл и перемешали до полного растворения. Содержание общего белка в полученном образце составляло 25,5 мг/мл. Определение концентрации активного лизоцима в исследуемом образце ИГ+Л проведено в трех повторностях (три дубля).

Для опыта готовили разведения ИГ+Л с концентрацией лизоцима 10 мкг/мл и 20 мкг/мл (соответствуют середине калибровочной кривой). Для каждой выбранной концентрации в триплете необходимо по 150 мкл раствора ИГ+Л, следовательно, для удобства внесения готовили не менее 200 мкл растворов выбранных концентраций:

1) разведение в 5 раз: 100 мкл исходного раствора ИГ+Л (100 мкг/мл)+400 мкл ФБ=500 мкл с концентрацией лизоцима 20 мкг/мл;

2) далее 200 мкл раствора с концентрацией 20 мкг/мл+200 мкл ФБ=400 мкл раствора ИГ+Л с концентрацией лизоцима 10 мкг/мл.

Схема анализа.

Результаты.

Концентрация активного лизоцима в образце ИГ+Л.

Результаты анализа активного лизоцима в модельном образце ИГ+Л, полученные в трех разных экспериментах по каждому варианту исследуемого образца, отличались не более, чем на 9%.

Список использованной литературы.

1. Ищенко У.В., Юпатова Т.Г. Влияние водного экстракта табака сигарет на уровень лизоцима и лактоферрина в ротовой жидкости. Иммунопатол., аллергол., инфектол., 2017, т.3, с.37-43.

2. Дорофейчук В.Г. Определение активности лизоцима нефелометрическим методом. Лабораторное дело, 1968, №1, с. 28-30.

3. «Способ определения активности лизоцима в биологической среде». Патент BY №22808 С1 МПК С 12N/36, С 12Q/06, G 01N33/48 - 2019.12.30, авторы: Земко В.Ю., Гончарова А.И., Окулич В.К., заявитель - Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет.

4. «Способ определения лизоцимной активности биологических объектов». Патент RU 2294373 С2 МПК C12Q 1/02, G01N 33/48 - 27.02.2007; авторы: Соловых Г.Н., Минакова В.В., Коробов В.П., Лемкина М.Л., Карнаухова И.В., Рябцева Е.А., Кануникова Е.А., заявитель - ГОУВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» МЗ РФ.

5. «Способ определения активности лизоцима в ротовой жидкости». Патент RU 2786802 С1, МПК G01N 33/52, C12Q 1/02, C12N9/36 - 26.12.2022; авторы: Абдрашитова А.Б., Мустафин И.Г., Гайнуллина Д.К., заявитель - ФГБОУВО «Казанский государственный медицинский университет» МЗ РФ.

6. «Способ определения активности лизоцима слюны». Патент RU 2170932 С1, МПК G01N 33/52 - 20/07/2001; авторы: Сторожук П.Г., Сафарова И.В., Еричев В.В., заявители и патентообладатели - они же.

7. J. Borgen and I. Romslo. Lyzozyme Determined in Serum or Urine by a Simple Nephelometric Method. Clin. Chem., 1977, v.23, №9, p.1599-1601.

8. S. Reitamo, M. Lalla & A. Huipero. Serum lysozyme: evaluation of a nephelometric assay. Scand. J. Clin. Lab. Invest, 1981, v. 41, p.329-332.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ автоматизированного определения концентрации активного лизоцима в биологических образцах, включающий подготовку стандартных образцов из лиофилизированного коммерческого препарата лизоцима куриного яйца для построения калибровочной кривой и стандартизированной при длине волны 450 нм по оптической плотности суспензии лиофилизированной культуры клеток Micrococcus lysodeicticus из коммерческого препарата. В ячейки охлаждаемого 96-луночного полистиролового планшета, помещенного на хладоэлемент, вносят в триплете по 50 мкл стандартные образцы лизоцима и исследуемые образцы в различных разведениях, выдерживают 6 мин при +4 - +8°С, затем в лунки планшета вносят по 150 мкл стандартизированной суспензии Micrococcus lysodeicticus при комнатной температуре и инкубируют 6 мин в термошейкере при +25°С и встряхивании 100 об/мин; измеряют оптическую плотность образцов при длине волны 450 нм на планшетном фотометре и рассчитывают концентрацию активного лизоцима, мкг/мл, в соответствии с калибровочной кривой. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов количественного определения концентрации активного лизоцима в биологических жидкостях человека для клинических целей. 2 ил., 8 табл., 3 пр.

Способ автоматизированного определения концентрации активного лизоцима в биологических образцах, включающий этапы:

- из лиофилизированного коммерческого препарата лизоцима из куриного яйца готовят маточный раствор с концентрацией 1 мг/мл, из которого перед проведением опыта готовят стандартные образцы с концентрациями от 0 до 40 мкг/мл для построения калибровочной кривой;

- из коммерческого препарата лиофилизированной культуры клеток Micrococcus lysodeicticus готовят суспензию, которую стандартизируют при длине волны 450 нм по оптической плотности в диапазоне 0,550-0,700 в плоскодонном 96-луночном планшете и используют в течение 1 ч после приготовления;

- в ячейки охлаждаемого 96-луночного полистиролового планшета, помещенного на хладоэлемент, вносят в триплете по 50 мкл все стандартные образцы лизоцима с концентрациями 0, 5, 10, 20, 30, 40 мкг/мл и все исследуемые образцы в различных разведениях, после чего выдерживают его в холодильнике 6 мин при температуре от +4 до +8°С;

- во все лунки планшета, охлаждаемого на хладоэлементе, вносят по 150 мкл стандартизированной суспензии Micrococcus lysodeicticus при комнатной температуре от +18 до +25°С;

- планшет с образцами инкубируют в термошейкере при температуре +25°С и встряхивании 100 об/мин в течение 6 мин;

- измеряют оптическую плотность образцов при длине волны 450 нм на планшетном фотометре и рассчитывают концентрацию активного лизоцима, мкг/мл, в соответствии с калибровочной кривой.