Способ определения активности лизоцима в ротовой жидкости Российский патент 2022 года по МПК G01N33/52 C12Q1/02 C12N9/36 

Изобретение относится к медицине, в частности к стоматологии и биотехнологии и может быть использовано для оценки уровня иммунной защиты от патогенной микрофлоры в ротовой жидкости, изучении ротовой жидкости при патологических процессах в полости рта, для определения эффективности индивидуальных средств гигиены рта.

Известен «Способ определения лизоцимной активности биологических объектов» (Патент RU №2294373, МПК C12Q 1/02, G01N 33/48 - 27.02.2007, Бюл. № 6), предусматривает выращивание тест-культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Тарасевича на жидкой питательной среде при температуре 27°С до оптической плотности 3,2-3,4. Подвергают лиофильной сушке. Из выращенной тест-культуры готовят суспензию, которую вносят в исследуемый биологический объект. После чего проводят вычисление лизоцимной активности биологического объекта по известному методу.

Недостаток данного способа: не определен уровень для соматически здоровых и с высоким уровнем активности кариеса пациентов; отсутствие количественного определения лизоцима в ротовой жидкости.

Известен «Способ определения активности лизоцима в биологической среде» (Патент BY №22808, МПК C12N 9/36, C12Q 1/06, G01N 33/48 - 2019.12.30), мясопептонном агаре выращивают культуру Micrococcus lysodeikticus, выделяют из нее пептидогликан, инкубируют его с 2%-ным раствором Конго красного и центрифугируют с получением пептидогликана, меченого Конго красным, затем готовят контрольную пробу, содержащую фосфатный буферный раствор, физиологический раствор и биологическую среду, и опытную пробу, содержащую фосфатный буферный раствор, пептидогликан, меченый Конго красным, и биологическую среду, пробы инкубируют и центрифугируют, в полученных надосадках определяют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 492 нм и вычисляют активность лизоцима Х в мкг/мл по формуле.

Недостатком данного технического решения является отсутствие количественного определения лизоцима в ротовой жидкости, необходимость выделение пептидогликана, необходимость дополнительных реактивов.

Наиболее близким к заявленному техническому решению является «Способ определения активности лизоцима слюны» (Патент RU № 2170932 С1, МПК G01N 33/52 - 20.07.2001, Бюл. № 20), в котором определяют начальную оптическую плотность в растворе смеси слюны, разведенной в 15 раз, с микрококком, после чего смесь термостатируют в течение 10 мин и вновь измеряют оптическую плотность, а затем определяют активность лизоцима (АЛ) по формуле АЛ = (Д0 - ДК) ⋅ 200, где Д0 - начальная оптическая плотность смеси; ДК - конечная оптическая плотность смеси; 200 - коэффициент пересчета.

Данный патент принят за прототип.

Недостаток данного способа отсутствует количественное определение лизоцима в ротовой жидкости.

Задачей заявляемого изобретения является модифицирование методик определения активности лизоцима в ротовой жидкости, при которой будет возможно количественное определение лизоцима, оптимизация расчёта данных.

Полезность заявленного способа заключается в том, что благодаря полученным результатам предоставляется возможность определения количественного состава лизоцима в ротовой жидкости, что в свою очередь позволить определять состояние иммунного статуса ротовой жидкости при наличии заболеваний на ранних этапах.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка модифицированной методики определения активности лизоцима в малом объеме ротовой жидкости, оценивается уровень местного иммунитета рта у пациентов с отягощенным соматическим статусом, внедрение в практическое здравоохранение.

Технический результат заявленного изобретения достигается за счет того, что измеряют оптическую плотность, особенность заключается в том, что сначала готовят культуру Micrococcus lysodeicticus ГИСК им. Л.А. Тарасевича в концентрации 10 млрд кл/мл, далее в пробирку с ротовой жидкостью объёмом 1 мл вносят 3 мл 1% физиологического раствора и 1 мл взвеси Micrococcus lysodeicticus в концентрации 10 млрд кл/мл, полученный раствор тщательно перемешивают и проводят измерение оптической плотности на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора (D0), после чего данный раствор помещают в термостат на 2,5 часа при температуре 37 градусов, после чего повторно измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора (D1) и вычисляют активность лизоцима ротовой жидкости по формуле:

L = (D0-D1) / D0*100%,

где L - активность лизоцима;

D0 - оптическая плотность до инкубации;

D1 - оптическая плотность после инкубации.

Способ осуществляется следующим образом:

Готовят раствор с внесением в пробирку 3 мл 1% физиологического раствора и 1 мл ротовой жидкости, добавляют 1 мл взвеси Micrococcus lysodeicticus штамм №25292 ГИСК им. Л.А. Тарасевича в концентрации 10 млрд кл/мл, приготовленную по оптическому стандарту мутности. Полученный раствор тщательно перемешивают и сразу производят измерение оптической плотности на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора, после чего помещают в термостат на 2,5 часа при температуре 37 градусов, далее оптическую плотность замеряют на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора и вычисляют активность лизоцима ротовой жидкости по формуле:

L = (D0 - D1) / D0*100%,

где L - активность лизоцима;

D0 - оптическая плотность до инкубации;

D1 - оптическая плотность после инкубации.

Способ поясняется конкретными клиническими примерами.

Пример 1.

Ротовая жидкость взята у пациента без соматической патологии, но с высокой активностью кариеса.

На первом этапе осуществляется приготовление культуры Micrococcus lysodeicticus ГИСК им. Л.А. Тарасевича в концентрации 10 млрд кл/мл. Далее в каждую пробирку с пробами ротовой жидкости объёмом 1 мл вносят 3 мл 1% физиологического раствора и 1 мл взвеси Micrococcus lysodeicticus. Тщательно перемешивают. Сразу же проводят измерение оптической плотности на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора. По данным измерения D0 равен 0,196. После чего помещают пробирки в термостат для инкубации на 2,5 часа при температуре 37°С. Через указанное время проводят повторное измерение оптическое плотности при аналогичных условиях. По данным измерения D1 равен 0,102.

Расчёт производится по формуле:

L = (D0-D1) / D0*100%,

где L - активность лизоцима;

D0 - оптическая плотность до инкубации;

D1 - оптическая плотность после инкубации.

L = (0,196-0,102) / 0,196 * 100% = 47,9%.

Пример 2.

Ротовая жидкость взята у пациента с психоневрологическими расстройствами и высоким уровнем активности кариеса.

На первом этапе осуществляется приготовление культуры Micrococcus lysodeicticus ГИСК им. Л.А. Тарасевича в концентрации 10 млрд кл/мл. Далее в каждую пробирку с пробами ротовой жидкости объёмом 1 мл вносят 3 мл 1% физиологического раствора и 1 мл взвеси Micrococcus lysodeicticus. Тщательно перемешивают. Сразу же проводят измерение оптической плотности на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора. По данным измерения D0 равен 0,364. После чего помещают пробирки в термостат для инкубации на 2,5 часа при температуре 37°С. Через указанное время проводят повторное измерение оптическое плотности при аналогичных условиях. По данным измерения D1 равен 0,096.

Расчёт производится по формуле:

L = (D0-D1) / D0*100% = (0,364-0,096) / 0,364 * 100% = 73,6%.

Таким образом, чем выше показатель, тем хуже иммунологический статус во рту.

По приведенным примерам видно, что в первом случае активность лизоцима ниже, чем во втором. Это свидетельствует о наличии патогенной микрофлоры и напряженном иммунном статусе примера 2.

Предлагаемый способ позволяет определять количественный состав лизоцима в ротовой жидкости, что, в свою очередь, позволить определять состояние иммунного статуса ротовой жидкости при наличии заболеваний на ранних этапах.

Изобретение относится к медицине, в частности к стоматологии и биотехнологии и может быть использовано для оценки уровня иммунной защиты от патогенной микрофлоры в ротовой жидкости и касается способа определения активности лизоцима в ротовой жидкости. Готовят культуру Micrococcus lysodeicticus ГИСК им. Л.А. Тарасевича в концентрации 10 млрд кл/мл, далее в пробирку с ротовой жидкостью объёмом 1 мл вносят 3 мл 1% физиологического раствора и 1 мл взвеси Micrococcus lysodeicticus в концентрации 10 млрд кл/мл. Полученный раствор тщательно перемешивают и проводят измерение оптической плотности на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора (D0). После этого данный раствор помещают в термостат на 2,5 часа при температуре 37 градусов, после чего повторно измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора (D1) и вычисляют активность лизоцима ротовой жидкости по формуле. Изобретение обеспечивает разработку модифицированной методики определения активности лизоцима в малом объеме ротовой жидкости, оценивая уровень местного иммунитета рта у пациентов с отягощенным соматическим статусом, внедрение в практическое здравоохранение. 2 пр.

Способ определения активности лизоцима в ротовой жидкости, включающий измерение оптической плотности, отличающийся тем, что сначала готовят культуру Micrococcus lysodeicticus ГИСК им. Л.А. Тарасевича в концентрации 10 млрд кл/мл, далее в пробирку с ротовой жидкостью объёмом 1 мл вносят 3 мл 1% физиологического раствора и 1 мл взвеси Micrococcus lysodeicticus в концентрации 10 млрд кл/мл, полученный раствор тщательно перемешивают и проводят измерение оптической плотности на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора (D0), после чего данный раствор помещают в термостат на 2,5 часа при температуре 37 градусов, после чего повторно измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора (D1) и вычисляют активность лизоцима ротовой жидкости по формуле:

L = (D0-D1) / D0*100%,

где L – активность лизоцима;

D0 – оптическая плотность до инкубации;

D1 – оптическая плотность после инкубации.