КРИСТАЛЛИЧЕСКИЙ ТРИГИДРОХЛОРИД ДЕОКСИСПЕРГУАЛИНА В β-ФОРМЕ, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2001 года по МПК C07K5/06 A61K38/05 A61P35/00 

Изобретение относится к новому биологически активному соединению - кристаллическому тригидрохлориду деоксиспергуалина в β-форме, обладающему противоопухолевой активностью и способу его получения, которые могут найти применение в медицинской промышленности и медицине.

Для получения гидрохлорида деоксиспергуалина известен синтетический способ, в котором используется катализируемая кислотами дегидратационная конденсация 7-гуанидиногептанамида с глиоксилилспермидином [1, 2]. Получаемый вышеуказанным синтетическим способом порошкообразный гидрохлорид деоксиспергуалина обладает такими нежелательными свойствами, как гигроскопичность и термическая неустойчивость.

Цель изобретения - улучшение гигроскопических и термических свойств гидрохлорида деоксиспергуалина.

Поставленная цель достигается описываемым кристаллическим тригидрохлоридом деоксиспергуалина в бета-форме формулы I

имеющим параметры диффракции рентгеновских лучей в порошкообразном состоянии, представленные в табл. A, обладающим противоопухолевой активностью и способом его получения, заключающимся в том, что порошок гидрохлорида деоксиспергуалина или его сиропоподобную водную суспензию кристаллизуют из водного этанола при концентрации воды не более 15% объема.

Концентрация этанола в растворе, который используют для кристаллизации, обычно составляет от 85 до 99,5% (объемных), предпочтительно от 90 до 98% объемных.

Температура кристаллизации не является существенней, при условии, что при этой температуре не происходит разложения гидрохлорида деоксиспергуалина, и обычно лежит в интервале от -20 до 50^oC, предпочтительно - в интервале от 5^oC до комнатной температуры. Время, требуемое для кристаллизации, составляет от 2 до 20 дней, в зависимости от количества используемого гидрохлорида, и обычно составляет около 10 дней. Введение на ранней стадии кристаллизации затравки в виде небольшого количества заранее полученных кристаллов, имеющих β-форму, может ускорить процесс кристаллизации.

Вместо порошкообразного гидрохлорида деоксиспергуалина можно использовать также сироп (сиропообразную водную суспензию) гидрохлорида деоксиспергуалина. В этом случае количество воды, содержащееся в сиропе, должно быть учтено, чтобы концентрация органического растворителя, например, этанола, в кристаллизационной системе, составляло 85-99,5%, предпочтительно 90-98% (по объему).

Соотношение используемого для кристаллизации органического растворителя и гидрохлорида деоксиспергуалина не является ограничивающим фактором, но обычно лежит в интервале от 3:1 до 20:1 (объем/масса).

Перемешивание во время кристаллизации уменьшает время кристаллизации; это время в таком случае составляет от нескольких часов до нескольких дней. Полученные таким образом кристаллы, имеющие β-форму, можно выделить любым обычным способом, например фильтрованием при пониженном давлении или фильтрованием при центрифугировании. Физико-химические свойства β-формы кристаллов гидрохлорида деоксиспергуалина.

1. Дифракция рентгеновских лучей.

Для изучения дифракции рентгеновских лучей использовали рентгеновский дифрактометр (Shimadzu XD-3A), оборудованный медной рентгеновской трубкой, графитовым монохроматором и сцинцилляционным детектором; результаты приведены на фиг. 1 и в таблице 1.

На фиг. 1 представлена рентгеновская дифрактограмма порошка β-формы кристаллов гидрохлорида деоксиспергуалина; на оси абсциссы отложен угол дифракции (в градусах), на оси ординат - интенсивность (в Кимп/сек).

Источник рентгеновского излучения: медная рентгеновская трубка. 40 кВ, 30 мА. λ = 1,54051.

Фильтр: графитовый монохроматор
2. Термический анализ.

На фиг. 2 представлены результаты дифференциального термического анализа (ДТА) и термогравиметрии (ТГ) для кристаллов гидрохлорида деоксиспергуалина, имеющих β-форму, полученные одновременно на приборе Shimadzu (модель DTG-40). Результаты представлены в координатах: температура (^oC) - оси абсцисса, масса (мг) или электронвольты (мкВ) - ось ординаты.

3. Гигроскопичность.

Для оценки гигроскопичности порошка и кристаллов гидрохлорида деоксиспергуалина, имеющих β-форму, измеряли изменение массы каждого образца после хранения в течение 24 часов при различных значениях относительной влажности ОВ (%). Результаты приведены в таблице 2.

Как показано в таблице 2 при всех уровнях влажности изменение массы в случае кристаллов, имеющих β-форму, меньше, чем изменение массы в случае порошка A. Более того, кристаллы, находящиеся в β-форме, не расплываются при ОВ, равной 64%, в то время как порошок при этом уровне влажности расплывается.

4. Термическая устойчивость.

Для оценки термической устойчивости β-формы кристаллов гидрохлорида деоксиспергуалина по сравнению с термической устойчивостью порошка A образцы хранили в точение 6 дней при 50^oC, и затем анализировали методам ЖХВД, измеряя количество неразложившегося вещества. Результаты приведены в таблице 3.

Как следует из таблицы 3 β-форма кристаллов обладает значительно улучшенной термической устойчивостью.

Данное изобретение поясняется нижеследующими примерами.

ПРИМЕР 1.

Водный раствор (100 мл) 40 г гидрохлорида деоксиспергуалина концентрируют при пониженном давлении, получая сиропообразный остаток (46 г). К остатку добавляют 20 мг кристаллов, имеющих α-форму, и смесь перемешивают при OВ, равной 15%, и при комнатной температуре. После перемешивания в течение 2 часов затвердевший остаток оставляют стоять в эксикаторе с силикагелем на 3 дня; получают 42 г кристаллов, находящихся в β-форме.

ПРИМЕР 2.

В пузырек, содержащий 100 мг порошкообразного гидрохлорида деоксиспергуалина, доставляют 0,5 мл 95%-ного (по объему) водного этанола, и оставляют раствор стоять 3 дня при 5^oC. Образовавшиеся в растворителе кристаллы отделяют фильтрованием при пониженном давлении и высушивают при пониженном давлении, получая 55 мг кристаллов, имеющих β-форму. Дифракционная картина, полученная на выделенных кристаллах, типична для β-формы кристаллов (см. фиг. 1).

ПРИМЕР 3.

Водный раствор (100 мл), содержащий 20 г гидрохлорида деоксиспергуалина, концентрируют при пониженном давлении, получая 24 г сиропообразного остатка. К остатку добавляют 75 мл этанола и затравку в виде 20 мг кристаллов, имеющих β-форму. Смесь оставляют на 9 дней при 5^oC. Кристаллы отделяют так, как это описано в примере 5, и сушат, получая 16 г кристаллов, находящихся β-форме.

ПРИМЕР 4.

Водный раствор (500 мл) гидрохлорида деоксиспергуалина (150 г) концентрируют при пониженном давлении, получая сиропообразный остаток (175 г). К остатку добавляют 1 литр этанола и перемешивают раствор при 5^oC в течение 2 дней. Образовавшиеся кристаллы отделяют фильтрованием при центрифугировании и высушивают при пониженном давлении, получая 129 г кристаллов, имеющих β-форму.

ПРИМЕР 5.

Водный раствор (4 литра) гидрохлорида деоксиспергуалина (950 г) концентрируют при пониженном давлении, получая сиропообразный остаток (1120 г). К остатку добавляют 1,5 литра этанола, и полученную суспензию переносят в емкость (объем 10 литров) для кристаллизации. К смеси добавляют 6,5 литров этанола и 2 г кристаллов, имеющих β-форму (добавление производят при перемешивании), и продолжают перемешивать при 15^oC в течение 4 дней. Кристаллы отделяют фильтрованием при центрифугировании и высушивают при пониженном давлении, получая 880 г кристаллов, находящихся в β-форме.

Описываемый кристаллический гидрохлорид деоксиспергуалина в β-форме является новым веществом и обладает улучшенными гигроскопичностью и термической устойчивостью, что ведет к удобству в обращении с деоксиспергуалином при приготовлении и хранении.

Терапевтическое действие на имплантированный рак у мышей.

Каждому из самцов мышей штамма BDF₁ (в возрасте 5 недель) инокулировали внутрибрюшинно по 10⁵ клеток лейкемии мышей L-1210, и лечили ежедневной инъекцией (внутрибрюшинно) тестируемого соединения растворенного в физиологическом растворе в течение 6 последовательных дней, начиная со дня инокулирования. Затем мышей наблюдали в течение 30 дней для определения степени пролонгирования периода выживания = 100 • Т/С = 100 • (среднее количество дней выживания для обработанной группы)/(среднее количество дней выживания для контрольной группы). Терапевтический эффект β-формы кристаллов и исходного порошка A деоксиспергуалинтригидрохлорида настоящего изобретения на лейкемию мышей L-1210 (результаты испытаний приведены в таблице 4).

Токсичность.

Средняя летальная доза (ЛД₅₀) β-формы кристаллов и исходного порошка A деоксиспергуалинтригидрохлорида настоящего изобретения как определено у мышей после однократного внутрибрюшинного введения, а также максимальная толерантная доза, выраженная в единицах общей дозы на единицу веса тела, которую вводили внутрибрюшинно раз в день в течение 5 последовательных дней, одинакова.

Острая и кумулятивная токсичность для мышей.

ЛД₅₀ (мг/гк), 25 - 50
Макс. толерантная доза (мг/кг) 150 <
Проведенные испытания показали, что описываемый кристаллический тригидрохлорид деоксиспергуалина в β-форме проявляет высокую противоопухолевую активность и при этом обладает прекрасной иммунодепрессантной активностью и низкой токсичностью, не уступая при этом исходному продукту.

При этом описываемое соединение обладает улучшенной гигроскопичностью, повышенной термической устойчивостью, что облегчает приготовление лекарственных средств на основе деоксиспергуалина и увеличивает срок их хранения.

Изобретение относится к кристаллическому тригидрохлориду деоксиспергуалина в β-форме:

имеющему следующие параметры диффракции рентгеновских лучей в порошкообразном состоянии:
15,77; 10,91; 4,88; 4,67;
I/I_I 0,32; 0,42; 0,38; 0,53;
4,14; 3,66; 3,31; 3,21;
I/I_I 0,70; 1,00; 0,52; 0,52,
обладающему противоопухолевой активностью и способу его получения, заключающемуся в том, что порошок или сиропообразную водную суспензию тригидрохлорида деоксиспергуалина кристаллизуют из водного этанола при концентрации воды не более 15 об.%, 2 с.п. ф-лы, 2 ил., 5 табл.

1. Кристаллический тригидрохлорид деоксиспергуалина в β-форме формулы I

имеющий следующие параметры дифракции рентгеновских лучей в порошкообразном состоянии:
15,77; 10,91; 4,88; 4,67;
I/I₁ 0,32; 0,42; 0,39; 0,53;
4,14; 3,66; 3,81; 3,21;
I/I₁ 0,70; 1,00; 0,52; 0,52,
обладающий противоопухолевой активностью. 2. Способ получения кристаллического деоксиспергуалина в β-форме формулы I

имеющий следующие параметры диффракции рентгеновских лучей в порошкообразном состоянии:
15,77; 10,91; 4,88; 4,67;
I/I₁ 0,32; 0,42; 0,39; 0,53;
4,14; 3,66; 3,31; 3,21;
I/I₁ 0,70; 1,00; 0,52; 0,52,
отличающийся тем, что порошок или сиропоподобную водную суспензию тригидрохлорида доксиспергуалина кристаллизуют из водного этанола при концентрации воды не более 15% объема.