ШТАММ БАКТЕРИЙ BIFIDOBACTERIUM COTURNIX, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ПТИЦЕВОДСТВА И ВЕТЕРИНАРИИ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и касается получения нового штамма, обладающего антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно патогенным микроорганизмам, с оптимальной температурой роста 42^oC, который может быть использован в приготовлении пробиотического препарата для птицеводства и ветеринарии.

Такой препарат может быть использован в птицеводстве для лечения острых кишечных инфекций (сальмонеллез, эшерихиоз и др.) и дисбактериозов, возникающих в результате антибиотикотерапии. Применение бифидобактерина нормализует деятельность кишечного тракта, препятствует образованию затяжных форм кишечных заболеваний, повышает сопротивляемость организма, показан ослабленной птице. Использование пробиотического препарата на основе бактерий Bifidobacterium позволит увеличить сохранность поголовья при проведении лечебно-профилактических мероприятий.

Известен штамм Bifidobacterium longum D4a200, который обладает высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно патогенным микроорганизмам [1,2] При совместном культивировании в количественном соотношении 1: 1 этот штамм подавляет рост Escherichia coli, Shigella flexneri, Proteus morgani на 98-100% Штамм обладает высокой устойчивостью к антибиотикам. На плотной и жидкой среде растет в присутствии 50 мг/мл канамицина, 200 мкг/мл ампициллина. Данный штамм специфичен для лечения кишечных инфекций и дисбактериозов у людей. Недостатком данного штамма является низкая температура роста (37^oC), что не позволяет использовать его в птицеводстве, поскольку температура в кишечном тракте птиц составляет 40-42^oC.

Наиболее близким к заявленному штамму прототипом, является штамм Bifidobacterium globosum, используемый для приготовления пробиотического препарата для ветеринарии [3] Штамм обладает высокой антагонистической активностью, поэтому препарат, изготовленный из него, высокоэффективен. Однако пробиотические препараты на основе микроорганизмов рода Bifidobacterium являются видоспецифичными для того объекта, от которого они выделены (в данном случае из кишечника свиней), и, следовательно, от этого зависит эффективность их терапевтического проявления. Поэтому недостатком данного штамма в случае применения в птицеводстве является его видоспецифичность, низкая температура роста (37^oC) и длительное время инкубирования 48 ч.

Задачей изобретения является получение штамма, обладающего высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно патогенным микроорганизмам, устойчивого к высоким концентрациям антибиотиков, способного к функционированию и размножению в интервале температур 38-42^oC, который может служить основой пробиотического препарата для птицеводства, неприхотливого к питательным средам и не требующего специального оборудования для выращивания.

Поставленная задача достигается использованием штамма Bifidobacterium bacterium coturnix ВКПМ Ас-1479, обладающего антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно патогенным микроорганизмам, устойчивого к высоким концентрациям антибиотиков.

Предлагаемый штамм выделен из нижнего отдела кишечника здорового перепела на селективных питательных средах, с последующим рассевом и скринингом наиболее стабильных форм.

Полученный штамм Bifidobacterium coturnix депонирован в ВКПМ НИИ генетика 30 05 1995 г. под регистрационным номером Ас-1479. Штамм депонирован с научным описание (паспортом).

Штамм Bifidobacterium coturnix ВКПМ Ас-1479 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки палочковидные, 4-5 мкм длиной, вариабельные по внешнему виду, встречаются Y или V-формы, булавовидные или лопатовидные. Цист и спор не образуют. Окраска по Граму грамположительны.

Культуральные признаки. Штамм хорошо растет на питательных средах, используемых для культивирования бифидобактерий печеночной среде Блаурокка, молочно-кукурузной среде в виде рыхлой массы. Отдельные колонии имеют форму мелких "комет" белого цвета. Оптимальная температура роста 38-42^oC, максимальная 45^oC. При выращивании на молочно-кукурузной среде сквашивают молоко с образованием сгустка к 24 ч инкубации.

Физиологические признаки. Анаэроб, индол и сероводород не образует, каталазоотрицательный, желатин не разжижает, не обладает гемолитическими свойствами, пигмента не образует, активность кислотообразования на молоке 70-90^o по Тернеру, на молочно-кукурузной среде 100- 120^oT через 48 ч инкубирования. Штамм ферментирует лактозу и сахарозу с образованием кислоты без газа.

Для пересевов бактерий Bifidobacterium coturnix ВКПМ Ас-1479 применяют среду Блаурокка следующего состава (г/л): пептон 10, лактоза 10, NaCl 5, L-цистин 0,1, агар-агар 0,75, печеночный бульон до 1 л. Культивирование проводят в анаэробных условиях при 38-42 ^oC. Для получения инокулята и биомассы используют молочно-кукурузную среду. Выход биомассы 10¹⁰ кое/мл.

Лабораторная проверка показывает его непатогенность для экспериментальных животных мышей, кур.

Штамм устойчив к пересевам на средах Блаурокка и молочно-кукурузной.

Определяющими отличиями предлагаемого штамма от штамма-прототипа являются: oптимальная температура роста и развития 38-42^oC; эффективность при использовании в птицеводстве (для лечения кишечных инфекции и дисбактериозов); простая питательная среда.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и не использовался в ветеринарии, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

Пример 1. Получение штамма Bifidobacterium coturnix ВКПМ Ас-1479 и наработка биомассы.

Новый штамм Bifidobacterium coturnix ВКПМ Ас-1479 получают путем выделения бактерий из нижнего отдела кишечника здорового перепела с последующим рассевом ряда разведений на среду Блаурокка. Несколько последующих пересевов позволяют выделить бактерии от сопутствующей микрофлоры. Культивирование бактерий проводят при 40^oC в анаэробных условиях. Идентифицирование штамма проводят в соответствии с определителем Берги.

Биомассу получают выращиванием бактерий на молочно-кукурузной среде следующего состава (г/л): сухое обезжиренное молоко 70, кукурузный экстракт 10, вода дистиллированная 500, вода водопроводная 500. Подготовленную среду инокулируют 10% бактериальной суспензии, инкубируют в анаэробных условиях при 40^oC 24 ч до образования сгустка. Концентрация бактерии к концу инкубирования достигает 10¹⁰ КОЕ/мл, активность кислотообразования составляет 110^oT.

Пример 2. Антагонистическая активность бактерий штамма Bifidobacterium coturnix ВКПМ Ас-1479 по отношению к патогенным и условно патогенным микроорганизмам.

Антагонистическую активность штамма смотрели по зоне задержки роста тест-микробов при методе штриховых посевов. Для этого 24-ч культуру Bifidobacterium coturnix, выращенную на молочно-кукурузной среде, наносят штриховым посевом на чашку Петри с СПА. Подготовленные суточные культуры тест-штаммов микроорганизмов наносят перпендикулярными штрихами по обеим сторонам штрихов культур бифидобактерий. Посевы инкубируют при 38^oC в течение 72 ч. Учитывают зоны задержки роста тест-культур в миллиметрах. Антагонистическая активность бифидобактерий расценивается как удовлетворительная, если зона задержки роста тест-культур не менее 10 мм.

В данном случае зона задержки роста тест-культур: Shigella flexneri 170 и 337, Shigella sonnei 174^"б", Staphylococcus aureus 20, Proteus Vulgaris F-30, составляет от 15 до 19 мм.

Пример 3. Определение устойчивости бактерии Bifidobacterium coturnix ВКПМ Ас-1479 к антибиотикам левомицетину и тетрациклину.

Изучение влияния антибиотиков на рост бактерий проводят в среде Блаурокка. Для этого готовят ряд разведений 24-ч культуры бактерий Bifidobacterium coturnix, выращенных на среде Блаурокка и засевают в подготовленные среды с разной концентрацией антибиотика по 0,1 мл инокулята. Образцы инкубируют при 40^oC в анаэробных условиях 48 ч. Сравнивают количество колоний, выросших в контрольном варианте и на среде с антибиотиком. Максимальная концентрация, при которой титр бактерий не отличается от контрольного, составляет для левомицетина 20 мкг/мл, тетрациклина 2 мкг/мл.

Пример 4. Сохранность бактерий штамма Bifidobacterium coturnix ВКПМ Ас-1479 в кормах.

Для изучения жизнеспособности бактерий Bifidobacterium coturnix при хранении в смеси с кормом и кормовыми добавками берут а) 10 г комбикорма, б) 10 г комбикорма и 5 мл патоки, добавляют суспензию бифидобактерий из 3-суточной культуры, выращенную в молочно-кукурузной среде (титр - 10¹⁰, кислотность 110^oT). Смотрят жизнеспособность бактерий при хранении смеси. Результаты представлены в таблице.

Таким образом, получен штамм, обладающий следующими преимуществами по сравнению с известным: оптимальная температура роста и развития 38-42^oC; эффективность при использовании в птицеводстве (для лечения кишечных инфекции и дисбактериозов); простая питательная среда.

Использование: биотехнология, ветеринарная микробиология и может быть использовано в ветеринарии при проведении лечебно-профилактических мероприятий. Сущность изобретения: штамм Bifidobacterium Coturnix выделен из кишечника здорового перепела на селективных питательных средах. Штамм обладает высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно патогенным микроорганизмам, устойчив к высоким концентрациям антибиотиков, способен к функционированию и размножению в интервале температуре 38-42^oC. Штамм может служить основой пробиотического препарата для птицеводства и ветеринарии. Штамм депонирован в ВКПМ под номером Ас-1479. 1 табл.

Штамм бактерий Bifidobacterium Coturnix ВКПМ Ас-1479, используемый для приготовления пробиотического препарата для птицеводства и ветеринарии.