ЭКСТРАКТ ИЗ КОЖУРЫ ПЛОДОВ ЦИТРУСОВЫХ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРА 3-ГИДРОКСИ-3-МЕТИЛГЛУТАРИЛ-СoА (ГМГ - СoА) -РЕДУКТАЗЫ Российский патент 2001 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к фармацевтической композиции для ингибирования активности 3-гидрокси-3-метилглутарил-CoA (ГМГ-CoA)-редуктазы у млекопитающих, которая содержит в качестве активного ингредиента эффективное количество экстракта из кожуры плодов цитрусовых в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем; и к пищевой композиции или композиции для питья, предназначенной для ингибирования активности ГМГ-CoA-редуктазы, которая содержит эффективное количество экстракта из кожуры плодов цитрусовых.

В последние годы сердечно-сосудистые заболевания, например атеросклероз и гиперхолестеринемия, все чаще становятся главной причиной смерти. Известно, что увеличение содержания холестерина в плазме вызывает осаждение жира, макрофагов и пенистых клеток на стенках кровеносных сосудов, и это осаждение приводит к образованию бляшек, а затем к атеросклерозу (Ross R.- Nature, 362, 801-809 (1993)). Одним из методов снижения уровня холестерина в плазме является диетотерапия, направленная на снижение потребления холестерина и липидов. Другим методом является снижение скорости биосинтеза холестерина, который происходит в печени. Сообщалось, что гиперхолестеринемия может эффективно поддаваться лечению путем снижения скорости биосинтеза холестерина посредством ингибирования ГМГ-CoA-редуктазы, которая опосредует синтез мевалоновой кислоты, являющейся промежуточным соединением в биосинтезе стеролов или изопреноидов (Cardiovascular Pharmacology. William W. Parmley & Kanu Chatterjee Ed., Wolfe Publishing, p. 8.6-8.7, 1994).

Поэтому были предприняты многочисленные попытки разработать лекарственные средства для ингибирования ГМГ-CoA-редуктазы; в результате чего было организовано промышленное производство нескольких соединений, происходящих от Penicillium sp. и Aspergillus sp. В частности, промышленностью стали выпускаться разработанные фирмой Merck Co., США, и Правастатин^®, разработанный фирмой Sankyo Co., Япония (C.D. R. Dunn, Stroke: Trends, Treatment and Markets, SCRIPT Report, PJB Publication Ltd., 1995). Однако известно, что эти лекарственные средства являются очень дорогостоящими и требуют введения в течение продолжительного периода времени, а также имеют побочное действие, заключающееся в повышении уровня креатинкиназы в печени. В соответствии с этим необходимость в разработке недорогостоящего и нетоксичного ингибитора ГМГ-CoA-редуктазы остается актуальной.

Кожура плодов цитрусовых была использована как средство для улучшения пищеварения. Однако не было каких-либо сообщений, касающихся ингибирующей активности экстракта из кожуры плодов цитрусовых.

В соответствии с этим целью настоящего изобретения является получение фармацевтической композиции для ингибирования активности ГМГ-CoA-редуктазы у млекопитающих.

Другой целью настоящего изобретения является получение пищевой композиции или композиции для питья, предназначенной для ингибирования активности ГМГ-CoA-редуктазы у млекопитающих.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для ингибирования активности 3-гидрокси-3-метилглутарил-CoA (ГМГ-CoA)-редуктазы у млекопитающих, которая содержит в качестве активного ингредиента эффективное количество экстракта из кожуры плодов цитрусовых в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для ингибирования активности 3-гидрокси-3-метилглутарил-CoA (ГМГ-CoA)-редуктазы у млекопитающих, которая содержит в качестве активного ингредиента эффективное количество экстракта из кожуры плодов цитрусовых в комбинации с фармацевтически приемлемыми наполнителями, носителями или разбавителями.

Цитрусовыми могут быть мандарины, апельсины, лимоны, грейпфруты и Poncirus trifoliata.

Экстракты из кожуры плодов цитрусовых могут быть получены любыми стандартными способами с использованием спирта или воды. Так, например, 5-100 л спирта или воды добавляют к 1 кг высушенной кожуры плодов цитрусовых, и смесь оставляют на период времени от 10 мин до 48 ч при температуре примерно от 5 до 80^oC в случае использования спирта или от 20 до 140^oC в случае использования воды. Этот процесс экстракции можно повторить от 1 до 3 раз. Полученный экстракт концентрируют, например, под вакуумом, и получают концентрированный экстракт из кожуры плодов. Кроме того, этот экстракт может быть получен путем обработки кожуры плодов цитрусовых раствором гидроксида кальция, добавления в этот раствор соляной кислоты для доведения pH от 4,0 до 4,5 и центрифугирования полученного раствора с получением осадков, флавоноидов, в качестве экстракта из кожуры плодов цитрусовых (FDA Report N FDA-BF-82/62, "Evaluation of health aspects of hesperidin, naringin and citrus bioflavonoide extracts as food ingredient", Natl. Technical Information Service PB 82-192931 (1982)).

Экстракт из кожуры плодов цитрусовых обладает ингибирующим действием на ГМГ-CoA-редуктазу в дозе 10 мг/кг/день или более, причем с возрастанием дозы его ингибирующее действие также возрастает.

Кроме того, несмотря на свою высокую эффективность, экстракт из кожуры плодов цитрусовых обнаруживает незначительную токсичность или митогенность в тестах на мышах. Более конкретно, экстракт из кожуры плодов цитрусовых не оказывает токсического действия при пероральном введении мышам в дозе 1000 мг/кг, которая соответствует пероральному введению дозы экстракта из кожуры плодов цитрусовых 50-100 г/кг массы тела для индивидуума весом 50 кг. Кроме того, экстракт из кожуры плодов цитрусовых не оказывает неблагоприятного действия на функцию печени.

Фармацевтический препарат может быть получен с использованием композиции любым стандартным способом. Для получения композиции активный ингредиент предпочтительно смешивают с носителем или разводят в носителе, или включают в носитель, который может быть изготовлен в виде капсулы, саше или в виде другой формы. В случае если этот носитель служит разбавителем, он может быть твердым, полутвердым или жидким материалом, действующим как носитель, наполнитель или среда для активного ингредиента. Так, например, указанные композиции могут быть изготовлены в форме таблеток, драже, порошка, саше, эликсира, суспензии, эмульсии, раствора, сиропа, аэрозоля, мягких и твердых желатиновых капсул, стерильного инъецируемого раствора, стерильного упакованного порошка и т.п.

Примерами подходящих носителей, наполнителей и разбавителей являются лактоза, декстроза, сахароза, сорбит, маннит, крахмал, аравийская камедь, альгинаты, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлоза, метилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза, поливинилпирролидон, вода, метилгидроксибензоаты, пропилгидроксибензоаты, тальк, стеарат магния и минеральное масло. Эти композиции могут, кроме того, включать наполнители, антиагглютинирующие агенты, смазывающие агенты, смачивающие агенты, корригенты, эмульгаторы, консерванты и т.п. Композиции настоящего изобретения могут быть изготовлены в виде препарата с быстрым, замедленным или пролонгированным высвобождением активного ингредиента после их введения млекопитающему с использованием любого из методов, хорошо известных специалистам.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть введена различными путями, включая пероральное, чреcкожное, подкожное, внутривенное и внутримышечное введение. Для человека обычно суточная доза экстракта из кожуры плодов цитрусовых может составлять в пределах от около 10 до 500 мг/кг массы тела, а предпочтительно 20-100 мг/кг массы тела, и может быть введена в виде разовой дозы или в виде дробных доз. Однако следует отметить, что конкретно вводимое количество активного ингредиента должно быть определено с учетом различных факторов, включая состояние, на которое направлено лечение, выбранный способ введения, возраст, пол и массу тела конкретного пациента, а также тяжесть симптомов заболевания пациента; а поэтому вышеуказанная доза не должна рассматриваться как некое ограничение объема изобретения.

Кроме того, экстракт из кожуры плодов цитрусовых может быть введен в пищу или напиток для ингибирования активности ГМГ-CoA-редуктазы. В соответствии с этим настоящее изобретение также относится к пищевой композиции или композиции для питья, предназначенной для ингибирования активности ГМГ-CoA-редуктазы и содержащей эффективное количество экстракта из кожуры плодов цитрусовых. В этом случае содержание экстракта из кожуры плодов цитрусовых в пище или напитке может варьировать в пределах от 0,1 до 50%.

Как описано выше, экстракт из кожуры плодов цитрусовых может быть использован как эффективное нетоксичное фармацевтическое средство для ингибирования активности ГМГ-CoA-редуктазы.

Нижеследующие примеры более подробно иллюстрируют настоящее изобретение, но не ограничивают его объем.

Кроме того, проценты, приведенные ниже для твердых веществ в твердой смеси, жидких веществ в жидкостях и твердых веществ в жидкостях даны в расчете мас./мас., об./об., и мас./об., соответственно; а все реакции, если это не указано особо, осуществляют при комнатной температуре.

Пример 1. Получение и анализ экстракта из кожуры плодов цитрусовых.

Кожуру плодов цитруса сушили при комнатной температуре, и к 6,7 кг высушенной кожуры добавляли 80 л 95%-ного этанола. Эту смесь оставляли на 24 ч при комнатной температуре и фильтровали, в результате чего получали экстракт и твердый остаток. Этот твердый остаток экстрагировали еще раз тем же самым способом. Полученные таким образом экстракты объединяли, концентрировали при пониженном давлении с использованием испарителя высокой мощности (роторного вакуумного испарителя EYELA N-11) и получали 1,7 кг концентрированного экстракта (d = 1,3 г/мл).

Концентрированный экстракт разводили в смеси ДМСО/метанола (1:1) при концентрации 10 мг/мл. 100 мкл полученного раствора подвергали высокоразрешающей жидкостной хроматографии (ВРЖХ) с использованием колонки Phenomenex Prodigy (5 мкм ODS(3) 100 A, 4,6 x 250 мм), предварительно уравновешенной 0,01 М смесью фосфорной кислоты/метанола (70:30). Образец элюировали смесью 0.01 М фосфорной кислоты/метанола (70:30) в течение 55 мин с постепенным увеличением концентрации метанола до 45% при скорости потока 0,6 мл/мин. В качестве стандартных материалов использовали 100 мкл (1 мг/мл) гесперидина и нарингина (Sigma Chemical Co., USA). Элюаты анализировали при 280 нм, и было обнаружено, что 1 кг экстракта из кожуры плодов цитрусовых содержит 5950 мг гесперидина и 280 мг нарингина.

Кроме того, ингредиенты экстракта из кожуры плодов цитрусовых были идентифицированы стандартным методом. Так, например, влажность определяли "сухим" методом при 105^oС; неочищенный белок определяли методом Kjeldahl; неочищенный липид определяли методом Soxhlet; свободный сахарид определяли методом Bertrand; неочищенную золу определяли путем озоления при 550-600^oС; а гесперидин и нарингин определяли с помощью ВЭЖХ. Результат представлен в табл. I.

Пример 2. Введение экстракта из кожуры плодов цитрусовых животному.

20 четырехнедельных крыс Sprague-Dawley (Taihan laboratory animal center, Korea) весом примерно 90-110 г каждая распределяли произвольным образом поровну на две группы с соответствующим пищевым рационом. Крысы в этих двух группах получали два разных рациона с высоким содержанием холестерина, то есть корм для лабораторных животных AIN-76 (ICN Biochemicals/Cleveland, ОН, USA), содержащий 1% холестерина (контрольная группа), и 1% холестерина + 16,7% экстракта из кожуры плодов цитрусовых, соответственно. Состав пищевого рациона для этих двух групп представлен в табл. II.

Крысы имели свободный доступ к специальному корму и к воде в течение шести недель; при этом количество употребляемой пищи ежедневно регистрировали, а крыс взвешивали каждые 7 дней, после чего полученные результаты анализировали. Все крысы обнаруживали нормальную прибавку в весе, и каких-либо значительных различий между этими двумя группами крыс в отношении количества употребляемой пищи и прироста в весе не наблюдалось.

Пример 3. Определение содержания общего холестерина, ЛПВП-холестерина и нейтральных липидов в плазме.

Влияние введения крысам экстракта из кожуры плодов цитрусовых на содержание холестерина и нейтральных липидов в плазме определяли следующим образом.

У крыс из двух групп брали пробы крови, и ЛПВП-фракции отделяли с использованием реагента для ЛПВП-холестерина (Sigma Chemical Co., Cat. N 352-3), содержащего сульфат декстрана. Содержание общего холестерина и уровень холестерина в ЛПВП определяли с использованием диагностического набора Sigma cat. N 352-100 (Sigma Chemical Co., USA) (Allain et al., Clin. Chem. 20, 470-475 (1974)). Уровень нейтральных липидов определяли с использованием диагностического набора Sigma cat. N 339-50 (Bucolo G. & David H., Clin. Chem. , 19, 476-482 (1973)). Результаты представлены в табл. III, где уровень общего холестерина в плазме крыс группы, получавшей корм, содержащий экстракт из кожуры плодов цитрусов, уменьшился на 35% по сравнению с контрольной группой.

Пример 4. Ингибирующее действие экстракта из кожуры плодов цитрусовых на активность ГМГ-CoA-редуктазы.

(Стадия 1) Получение микросом
Для определения действия экстракта из кожуры плодов цитрусовых, содержащегося в корме для крыс, на активность ГМГ-CoA-редуктазы (фермента, регулирующего синтез холестерина в печени) из ткани печени были выделены микросомы, используемые в качестве источника фермента.

Сначала крыс двух групп умерщвляли путем декапитации, после чего вырезали печень и сразу помещали в охлажденную льдом среду для гомогенизации (50 мМ KH₂PO₄ (pH 7,0), 0,2 М сахарозы, 2 мМ дитиотреитола (ДТТ)). Печень гомогенизировали в среде для гомогенизации (2 мл среды/г печени) в течение 15 с с использованием смесителя Waring (трехходового стеклянного гомогенизатора типа Potter-Elvehjem с тефлоновым пестиком, приводимым в движение мотором). Гомогенат центрифугировали при 15000 х g в течение 10 мин, и полученный таким образом супернатант центрифугировали при 100000 х g в течение 75 мин, в результате чего получали микросомный осадок, который затем ресуспендировали в среде для гомогенизации, содержащей 50 мМ EDTA, и центрифугировали при 100000 х g в течение 60 мин. Супернатант, содержащий микросомы, использовали в качестве источника фермента.

(Стадия 2) Анализ на ГМГ-CoA-редуктазу
Активность ГМГ-CoA-редуктазы определяли с использованием [¹⁴C] ГМГ-CoA по методу Шапиро и др. (Biochemica et Biophysica Acta, 370, 369-377 (1974)) следующим образом.

Фермент в супернатанте, содержащем микросомы, полученные в Стадии 1, активировали в течение 30 мин при 37^oC. В реакционную пробирку добавляли 20 мкл буфера для анализа ГМГ-CoA-редуктазы (0,25 М KH₂PO₄ (pH 7,0), 8,75 мМ EDTA, 25 мМ ДТТ, 0,45 М KCl и 0,25 мг/мл BSA), 5 мкл 50 мМ NADPH, 5 мкл [¹⁴C] ГМГ-CoA (0,05 мкКи/пробирка, конечная концентрация 120 мкМ) и 10 мкл активированного микросомного фермента (0,03-0,04 мг), и полученную смесь инкубировали в течение 30 мин при 37^oC. Реакцию прекращали путем добавления к смеси 10 мкл 6 М HCl, и полученную смесь инкубировали 15 мин при 37^oC для полной лактонизации продукта (мевалоната). Осадок удаляли путем центрифугирования при 10000 х g в течение 1 мин, и супернатант наносили на ТСХ-пластину с силикагелем 60G (Altech. Inc., Newark, USA), а затем проявляли смесью бензола: ацетона (1:1, об./об.). Область, имеющую значение R_f в пределах от 0,65 до 0,75, удаляли путем соскабливания одноразовыми покровными стеклами и анализировали на радиоактивность с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика Microbeta 1450 (Wallacoy, Finland). Активность фермента вычисляли в пикомолях мевалоновой кислоты, синтезированной за 1 мин, на 1 мг белка (пмоль/мин/мг белка). Результат представлен в табл. IV,
Как можно видеть из табл. IV, крысы контрольной группы обнаруживали относительно высокую активность ГМГ-CoA-редуктазы, тогда как активность ГМГ-CoA-редуктазы, наблюдаемая у крыс группы, получавшей экстракт из кожуры плодов цитрусовых, составляла на 34% меньше, чем у крыс контрольной группы.

Пример 5. Токсичность перорально вводимого экстракта из кожуры плодов цитрусовых.

7-8-недельных и не зараженных какими-либо специфическими патогенами мышей-самок ICR (8 животных) весом примерно 25-29 г каждая и мышей-самцов (8 животных) весом примерно 34-38 г каждая выдерживали при температуре 22±1^oC в условиях влажности 55 ± 5% и в режиме смены дня и ночи: 12 ч день/12 ч ночь. Корм (Cheiljedang Co., корм для мышей и крыс) и воду стерилизовали и давали мышам.

Экстракт из кожуры плодов цитрусовых растворяли в 0,5% Твина 80 до концентрации 100 мг/мл, и полученный раствор перорально вводили мышам в количестве 0,2 мл на 20 г массы тела мыши. Раствор вводили за один раз, и после этого в течение 10 дней мышей наблюдали на признаки неблагоприятного воздействия или на их гибель в соответствии со следующей схемой: 1, 4, 8 и 12 ч после введения раствора, а затем через каждые 12 ч после введения. Для оценки действия экстракта из кожуры цитрусовых каждый день регистрировали вес мышей. Кроме того, на 10-й день мышей умерщвляли и визуально осматривали внутренние органы.

На 10-й день все мыши были живы, и экстракт из кожуры цитрусовых в дозе 1000 мг/кг не оказывал какого-либо токсического действия. После аутопсии каких-либо патологических аномалий у мышей установлено не было, и за 10-дневный период у мышей не наблюдалось какой-либо потери веса. В соответствии с этим можно сделать вывод, что экстракт из кожуры плодов цитрусовых нетоксичен при его пероральном введении животному.

Нижеследующий пример композиций приводится лишь в иллюстративных целях и не должен рассматриваться как ограничение объема изобретения.

Пример композиции
Твердые желатиновые капсулы были получены с использованием следующих ингредиентов (мг/капсула):
Активный ингредиент (экстракт из кожуры плодов цитрусовых) - 20
Крахмал сухой - 160
Стеарат магния - 20
Всего - 200 мг
Несмотря на то что настоящее изобретение описано выше на конкретных примерах его осуществления, однако следует отметить, что в него могут быть внесены изменения, не выходящие за рамки объема формулы изобретения.

Композиция может быть использована в медицине, а именно в кардиологии. Предложенная фармацевтическая композиция для ингибирования активности 3-гидрокси-3-метилглутарил-СоА (ГМГ - СоА)-редуктазы у млекопитающих содержит в качестве активного ингредиента эффективное количество экстракта из кожуры плодов цитрусовых в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Пищевая композиция или композиция для питья, предназначенные для ингибирования активности ГМГ-СоА-редуктазы, содержат эффективное количество экстракта из кожуры плодов цитрусовых. Применение предложенной композиции позволяет эффективно снизить уровень холестерина в плазме. 3 с. и 3 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Фармацевтическая композиция для ингибирования активности 3-гидрокси-3-метилглутарил-СоА (ГМГ - СоА) - редуктазы у млекопитающих, которая содержит в качестве активного ингредиента эффективное количество спиртового экстракта из кожуры плодов цитрусовых в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. 2. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанным млекопитающим является человек. 3. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанными цитрусовыми являются мандарины, апельсины, лимоны, грейпфруты и Poncirus trifoliata. 4. Фармацевтическая композиция по п.2, где указанное эффективное количество экстракта из кожуры плодов цитрусовых составляет в пределах от 10 до 500 мг/кг массы тела/день. 5. Пищевая композиция для ингибирования активности 3-гидрокси-3-метилглутарил-СоА (ГМГ - СоА) - редуктазы у млекопитающих, которая содержит 0,1 - 50% спиртового экстракта из кожуры плодов цитрусовых, остальное приемлемые пищевые добавки. 6. Композиция для питья, предназначенная для ингибирования активности 3-гидрокси-3-метилглутарил-СоА (ГМГ - СоА) - редуктазы у млекопитающих и содержащая 1 - 50% спиртового экстракта из кожуры плодов цитрусовых, остальное - приемлемые пищевые добавки.