НАРИНГИН И НАРИНГЕНИН В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРА 3-ГИДРОКСИ-3-МЕТИЛГЛУТАРИЛ КОА (HMG-COА) РЕДУКТАЗЫ Российский патент 2001 года по МПК A61K31/335 

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для ингибирования активности 3-гидрокси-3-метилглутарил Koa (HMG-CoA) редуктаэы у млекопитающего, которая содержит эффективное количество нарингина или нарингенина в качестве активного ингредиента вместе с фармацевтически приемлемым носителем, и к композиции в виде пищевого продукта или напитка для ингибирования аткивности HMG-CoA редуктазы, которая включает эффективное количество нарингина или нарингенина.

Предпосылки изобретения
За последние годы заболевания сердца и системы кровообращения вследствие поражения коронарных артерий, например атеросклероз и гиперхолестеринемия, становятся основной причиной случаев смерти. Сообщалось, что возросший уровень холестерина в плазме вызывает отложение жира, макрофагов и ксантомных клеток на стенках кровеносных сосудов, причем такое отложение ведет к образованию бляшки, а затем к атеросклерозу (Rose, R., Nature, 362, 801-809 (1993)). Одним из способов снижения уровня холестерина в плазме является диетотерапия, направленная на снижение поступления внутрь холестерина и липидов. Другим способом является снижение скорости биосинтеза холестерина, который происходит в печени. По имеющимся данным гиперхолестеринемию можно эффективно лечить с помощью снижения скорости биосинтеза холестерина посредством ингибирования активности HMG-CoA редуктазы, которая опосредует синтез мевапоновой кислоты, промежуточного продукта в биосинтезе стеринов или изопреноидов (Cardiovascular Pharmacology, William W. Parmley and Kanu Chatterjee Ed., Woffe Publishing, pages 8.6-8.7, 1994).

Поэтому предпринимались многочисленые усилия для разработки лекарственных препаратов для ингибироваия HMG-CoA редуктазы; и в результате на рынке появилось несколько соединений, полученных из видов Penicillium и Aspergillus. В частности, в продажу поступили Ловастатин^® и Симвастатин^® разработанные Merck Co. , U.S.A., и Правастатин^® разработанный Sankyo Co., Japan (C. D. R. Dunn, Stroke: Trends, Treatment and Markets, SCRIPT Report, PJB Publications Ltd., 1995). Однако эти лекарственные препараты очень дорогие, и, как известно, их длительное введение вызывает неблагоприятный побочный эффект увеличения содержания креатинкиназы в печени. Соответственно, сохраняется необходимость в разработке недорогого и нетоксичного ингибитора HMG-CoA редуктазы.

Наргинин и агликон наргинина нарингенин представляют собой флавоноиды, обнаруживаемые в лимонах, грейпфрутах, мандаринах и апельсинах (Citrus sinensis), и они имеют следующие структуры (Horowitz, Gentili, Tetrahedron, 19,773 (1963)):

Наргинин использовался в качестве горькой вкусовой добавки, подслащивающего вещества или основы жевательной резинки. Однако не было данных об активности нарингина или нарингенина, ингибирующей активность HMG-CoA редуктазы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Соответственно, объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для ингибирования активности HMG-CoA редуктазы у млекопитающих.

Другим объектом настоящего изобретения является композиция в виде пищевого продукта или напитка для ингибирования активности HMG-CoA редуктазы у млекопитающих.

В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция для ингибирования активности 3-гидрокси-3-метилглутарил Koa (HMG-CoA) редуктазы у млекопитающего, которая включает эффективное количество нарингина или нарингенина в качестве активного ингредиента вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для ингибирования активности HMG-CoA редуктазы, которая содержит в качестве активного ингредиента нарингин или нарингенин в сочетании с фармацевтически приемлемыми наполнителями, носителями или разбавителями.

Нарингин или нарингенин могут экстрагироваться из шкурки цитрусовых или синтезироваться в соответствии со способом, описанным Rosenmund, Rosenmund, Ber. , 61, 2608 (1958) и Zemplen, Bognar, Ber., 75, 648 (1942). Кроме того, нарингенин может также быть получен с помощью гидролиза нарингина.

Нарингин или нарингенин оказывают ингибирующее действие на HMG-CoA редуктазу в дозе 0,05 мг/кг/сут или более, причем ингибирующий эффект увеличивается с увеличением их дозы.

Кроме того, несмотря на их высокую активность, нарингин или нарингенин проявляют низкую токсичность или мутагенность в исследованиях на мышах. Более конкретно, наргинин не проявляет токсичности при его оральном введении мыши в дозировке 1000 мг/кг, которая соответствует дозе перорального введения нарингина от 50 до 100 г/кг массы тела для человека массой 50 кг. Кроме того, нарингин и нарингенин не оказывают неблагоприятные воздействия на функцию печени.

Фармацевтическая композиция может быть получена с использованием композиции в соответствии с любой из обычных процедур. При получении композиции нарингин или нарингенин предпочтительно примешивают или разбавляют носителем или заключают внутрь носителя, который может быть в виде капсулы, удлиненной таблетки или другого контейнера. Когда в качестве разбавителя служит носитель, он может быть твердым, полутвердым или жидким материалом, действующим в качестве носителя, наполнителя или среды для активного ингредиента. Таким образом, композиции могут быть в виде таблетки, пилюли, порошка, удлиненной таблетки, эликсира, суспензии, эмульсии, раствора, сиропа, аэрозоля, мягкой и твердой желатиновой капсулы, стерильного раствора для инъекций, стерильного упакованного порошка и им подобных.

Примерами подходящих носителей, наполнителей и разбавителей являются лактоза, декстроза, сахароза, сорбитол, маннитол, крахмалы, смола акации, алгинаты, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлоза, метилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза, поливинилпирролидон, вода, метилгидроксибензоаты, пропилгидроксибензоаты, тальк, стеарат магния и минеральное масло. Композиции могут дополнительно включать наполнители, средства против агглютинации, смазывающие средства, увлажнители, ароматизаторы, эмульсификаторы, консерванты и им подобные. Композиции изобретения могут быть составлены так, чтобы обеспечить быстрое, длительное или отсроченное высвобождение активного ингредиента после их введения млекопитающему с помощью применения любой из методик, хорошо известных в данной области.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может вводиться различными путями, включая пероральное, чрескожное, подкожное, внутривенное и внутримышечное введение. Если пациентом является человек, обычная ежесуточная доза нарингина или нарингенина может быть в диапазоне от приблизительно 0,05 до 300 мг/кг массы тела, предпочтительно от 0,5 до 30 мг/кг массы тела, и может вводиться в однократной дозе или в разделенных дозах. Однако следует понимать, что действительно вводимое количество активного ингредиента следует определять в свете различных сопутствующих факторов, включая состояние, которое предполагается лечить, выбранный путь введения, возраст, пол и массу тела конкретного пациента, а также тяжесть симптоматики у пациента, и поэтому указанная выше доза не должна никоим образом ограничивать объем притязаний изобретения.

Кроме того, нарингин и нарингенин могут включаться в состав пищевых продуктов и напитков с цепью ингибирования активности HMG-CoA редуктазы. Соответственно, настоящее изобретение относится также к композиции в виде пищевого продукта или напитка дня ингибирования активности HMG-CoA редуктазы, которые содержат эффективное количество нарингина или нарингенина.

Как описано выше, нарингин или нарингенин могут использоваться в качестве эффективного нетоксичного фармацевтического средства для ингибирования активности HMG-CoA редуктазы.

Следующие примеры предназначены для дальнейшей иллюстрации настоящего изобретения без ограничения диапазона его притязаний.

Кроме того, приведенные ниже процентные доли содержания твердых веществ в твердых веществах, жидких веществ в жидких веществах и твердых веществ в жидких веществах приведены соответственно на основании мас./мас., об./об. и мас./об., и, при отсутствии других указаний, все реакции проводились при комнатной температуре.

Пример 1. Введение нарингина и нарингенина животному
Крыс линии Sprague-DawItey в возрасте 30 нед. (Talhan laboratory animal center, Korea), каждую массой приблизительно от 90 до 110 г, методом случайной выборки делят на три одинаковые группы, получающие различный рацион. Крысам из этих трех групп дают три различных рациона с высоким содержанием холестерина, т. е. , рацион для лабораторных животных AIN-76 (ICN Biochemicals, Cleveland, ОН, U. S. A. ), содержащий соответственно 1% холестерин (контрольная группа), 1% холестерин плюс 0,1% нарингин (группа нарингина), и 1% холестерин плюс 0,1% нарингенин (группа нарингенина). Составы рационов, скармливаемых трем группам, показаны в таблице 1.

Крысам в течение шести недель дают возможность без ограничений съедать корм определенного рациона вместе с водой, количество съедаемого корма ежедневно регистрируют и 1 раз в 7 дней крыс взвешивают, а затем данные регистрации анализируют. У всех крыс наблюдалась нормальная скорость роста и не наблюдалось достоверное различие среди трех групп с точки зрения количества съедаемого корма и прибавки массы тела.

Пример 2. Определение содержания общего холестерина, холестерина ЛВП и нейтральных липидов в плазме
Влияние введения нарингина и нарингенина крысам на содержание холестерина и нейтральных липидов в плазме определяют следующим образом.

Образцы крови берут у крыс трех групп рационов и с помощью реактива холестерина ЛВП (Sigma Chemical Co., Cat, No. 352-3), содержащего декстран-сульфат, выделяют из них фракции ЛВП плазмы. Уровень общего холестерина и холестерина ЛВП определяют с помощью Sigma Diagnostic Kit Cat. N 352- 100 (Sigma Chemical Co. , U. S. A. ) (Allain et al., Clin. Chem., 20, 470-475 (1974)). Уровень нейтральных липидов определяют с использованием Sigma Diagnostic Kit Cat. N 339-50 (Bucolo, G. and David, H., Clin. Chem., 19, 476-482 (1973)). Результат показан в таблице II, в которой уровень общего холестерина плазмы снизился на 32% в группе, которой скармливали нарингин, и на 18% - в группе крыс, которым скармливали нарингенин, в сравнении с контрольной группой.

Пример 3. Активность нарингина и нарингенина при ингибировании HMG-CoA редуктазы
(Этап I) Получение микросом
Для определения влияния наргинина и нарингенина, скармливаемых крысам, на активность HMG-CoA редуктазы, регуляторного фермента синтеза холестерина, в печени, микросомы выделяют из печеночной ткани, которую предполагается использовать в качестве источника фермента.

Сначала крыс из трех групп забивают путем декапитации и печень иссекают и немедленно помещают в ледяную гомогенизационную среду (50 мМ KH₂PO₄ (pH 7,0), 0,2 М сахароза, 2 мМ дитиотреитол (ДТТ)). Ткань печени в течение 15 с гомогенизируют в гомогенизационной среде (2 мл среды/1 г печени) смесителем Waring (три удара приводимого в движение моторчиком тефлонового пестика в стеклянном гомогенизаторе типа Potter-Elvehejm). Гомогенизат центрифугируют при 15000 • g в течение 10 мин и полученную таким образом надосадочную жидкость центрифугируют при 15000 • g в течение 75 мин для получения осадка микросом в пробирках после центрифугирования, который затем повторно суспензируют в гомогенизационной среде, содержащей 50 мМ ЭДТК, и центрифугируют в течение 60 мин при 100000 • g. В качестве источника фермента используют надосадочную жидкость, содержащую микросомы.

(Этап II) Количественное определение HMG-CoA редуктазы
Активность HMG-CoA редуктазы определяют с использованием [C"]HMG-CoA в соответствии со способом Shapiro et al. (Biochemica et Biophysica Acta, 370, 369-377 (1974)) следующим образом.

Фермент в надосадочной жидкости, содержащей микросомы, полученные на этапе I, активируют при 37^oC в течение 30 мин. В реакционную пробирку добавляют 20 мкл буфера (0,25М KH₂PO₄ (pH 7,0), 8,75 мМ ЭДТК, 25 мМ ДТТ, 0,4М KCl и 0,25 мг/мл альбумина бычьей сыворотки) для количественного анализа HMG-CoA редуктазы, 5 мкл 50 мМ NADPH, 5 мкл [C¹⁴]HMG-CoA (0,05 мкКи/пробирку, конечная концентрация 120 мкМ) и 10 мкл активированного микросомального фермента (0,03-0,04 мг) и смесь инкубируют при 37^oC в течение 30 мин. Реакцию прекращают добавлением в смесь 10 мкл 6М HCl, и смесь инкубируют при 37^oC в течение 15 мин для обеспечения возможности полной лактонизации продукта (мевалоната). Осадок удаляют с помощью центрифугирования при 10000 •g в течение 1 мин и надосадочную жидкость наносят на пластинку силикагеля 60G для тонкослойной хроматографии (Altech, Inc., Newark, U.S.A. ), а затем проявляют с помощью бензола:ацетона (1:1, об./об.). Область, имеющую величину R_f в диапазоне от 0,65 до 0,75, удаляют с помощью соскабливания одноразовым эллингом и проводят количественное определение радиоактивности с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика Microbeta (Wallacoy, Finland). Активность ферментов рассчитывают в пикомолях мевалоновой кислоты, синтезированной за 1 мин на 1 мг белка (пкмолей/мин/мг белка). Результат показан в таблице III.

Как видно из табл. III, у крыс контрольной группы выявлена относительно высокая активность HMG-CoA редуктазы, в то время как активность HMG-CoA редуктазы, наблюдавшаяся у группы крыс, которым скармливали нарингин, и у группы крыс, которым скармливали нарингенин, ниже, чем у контрольной группы соответственно на 25% и 31%.

Пример 4. Токсичность нарингина при оральном введении
Самок мышей линии ICR, свободных от специфического патогена, в возрасте от 7 до 8 нед. (8 голов) массой приблизительно от 25 до 29 г каждая и самцов (8 голов) массой приблизительно от 34 до 38 г каждый содержат в условиях температуры 22±1^oC, влажности 55±5% и светового периода 12 ч свет/12 ч темнота. Корм (корм для мышей и крыс Chelljedang Co.) и воду стерилизуют и скармливают мышам.

Наргинин растворяют в 0,5% Tween 80 до концентрации 100 мг/мл, и раствор перорально вводят мышам в количестве 0,2 мл на 20 г массы тела мыши. Раствор вводят однократно и мышей для выявления признаков неблагоприятных эффектов или смерти наблюдают в течение 10 дней по следующей схеме: 1, 4, 8 и 12 ч после введения и 1 раз в 12 ч в последующем. Изменения массы тела мышей регистрируют ежедневно для исследования воздействия нарингина. Затем на 10-й день мышей забивают и проводят визуальное исследование внутренних органов.

На 10-й день все мыши были живы, и наргинин не проявлял токсического действия в дозе 1000 мг/кг. Вскрытие показало, что у мышей не возникли патологические изменения, и в течение 10-дневного периода исследования потеря массы тела не наблюдалась. Соответственно, был сделан вывод, что наргинин не токсичен при оральном введении животному.

Следующий пример композиции предназначен только для иллюстрации и никоим образом не имеет намерений ограничить объем притязаний изобретения.

Пример композиции
Твердые желатиновые капсулы готовят с использованием следующих ингредиентов, мг/капсула:
Активный ингредиент (наргинин) - 20
Крахмал высушенный - 160
Стеарат магния - 20
Всего - 200
Хотя изобретение было описано с точки зрения представленных выше конкретных вариантов реализации, следует понимать, что специалисты в этой области могут внести в изобретение различные модификации и изменения, которые также подпадают под объем притязаний изобретения, определенный прилагаемой формулой изобретения.

Пример 1. Продукты питания, содержащие нарингин или нарингенин.

Продукты питания, содержащие нарингин или нарингенин, были приготовлены следующим образом.

(1) Приготовление томатного кетчупа и соуса.

Нарингин добавляли в томатный кетчуп или соус в количестве 10 и 20 массовых процентов, соответственно, для получения томатного кетчупа или соуса, полезного для здоровья.

В альтернативном варианте нарингенин добавляли в томатный кетчуп или соус в количестве 1 и 10 массовых процентов соответственно получая томатный кетчуп или соус, полезный для здоровья.

(2) Приготовление продуктов питания из пшеничной муки.

Нарингин добавляли в пшеничную муку в количестве 10 и 30 массовых процентов соответственно и из полученной смеси готовили хлеб, пироги, печенье, крекер и лапшу, получая мучные продукты, полезные для здоровья.

В альтернативном варианте эти продукты питания готовили с использованием пшеничной муки, содержащей нарингенин в количестве 5 и 10 массовых процентов соответственно.

(3) Приготовление супов и подливок.

Нарингин добавляли в супы и подливки в количестве 1 и 15 массовых процентов, соответственно, получая супы и подливки, полезные для здоровья.

В альтернативном варианте эти продукты питания готовили с использованием супов и подливок, содержащих нарингенин в количестве 0,5 и 10 массовых процентов соответственно.

(4) Приготовление говяжьего фарша.

Нарингин добавляли в говяжий фарш в количестве 5 и 25 массовых процентов соответственно для получения говяжьего фарша, полезного для здоровья.

В альтернативном варианте эти продукты питания готовили с использованием говяжьего фарша, содержащего нарингенин в количестве 10 и 25 массовых процентов соответственно.

(5) Приготовление молочных продуктов.

Нарингин или нарингенин добавляли в молоко в количестве от 0,5 до 10 массовых процентов и из этого молока готовили различные молочные продукты, такие как масло и мороженное.

Однако в случае приготовления сыра в свернувшийся молочный белок добавляли порошок или экстракт цедры цитрусовых; и при приготовлении йогурта в свернувшийся молочный белок, полученный после ферментации, добавляли порошок или экстракт цедры цитрусовых.

Пример 2. Напитки, содержащие нарингин или нарингенин.

(1) Приготовление сока из овощей.

100 граммов нарингина или нарингенина добавляли в 1000 миллилитров томатного или морковного сока, получая овощной сок, полезный для здоровья.

(2) Приготовление фруктового сока.

20 граммов нарингина или нарингенина добавляли в 1000 миллилитров яблочного или грейпфрутового сока, получая фруктовый сок, полезный для здоровья.

(3) Приготовление газированных напитков.

10 граммов нарингина или нарингенина добавляли в 1000 миллилитров кока-колы^® или пепси-колы^®, получая газированные напитки, полезные для здоровья.

Фармацевтическая композиция может быть использована в медицине, а именно для ингибирования активности 3-гидрокси-3-метилглутарил Коа (HMG-CoA) редуктазы у млекопитающих. Композиция содержит эффективное количество нарингина или нарингенина в качестве активного ингредиента вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Композиция может быть представлена в виде пищевого продукта или напитка для ингибирования активности 3-гидрокси-3-метилглутарил Коа (HMG-CoA) редуктазы у млекопитающих, содержащего эффективное количество нарингина или нарингенина. Композиция эффективно снижает уровень холестерина в плазме крови. 2 с. и 7 з.п.ф-лы, 3 табл.

1. Применение нарингина или нарингенина для ингибирования активности 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА (HMG-GoA) редуктазы у млекопитающего. 2. Применение по п.1, где млекопитающим является человек. 3. Композиция для ингибирования активности 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА (HMG-CoA) редуктазы у млекопитающего, содержащая нарингин или нарингенин в качестве активного компонента. 4. Композиция по п.3, где млекопитающим является человек. 5. Композиция по п.3, где эффективное количество нарингина находится в диапазоне от 0,5 до 300 мг/кг массы тела/сут. 6. Композиция по п.3, где эффективное количество нарингенина находится в диапазоне от 0,5 до 300 мг/кг массы тела/сут. 7. Композиция по п.3, представляющая собой фармацевтическую композицию. 8. Композиция по п.3, представляющая собой композицию в виде пищевого продукта. 9. Композиция по п.3, представляющая собой композицию в виде напитка.