СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИСКЛЕРОТИЧЕСКОЙ И ЖЕЛЧЕГОННОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1996 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается производства лекарственных средств из растительного сырья.

Средства растительного происхождения, обладающие выраженной антисклеротической и желчегонной активностью, как правило, содержат комплекс полифенольных соединений (флавоны, флавонолы, изофлавонолы, оксикоричные кислоты и др.).

Известен способ получения комплекса полифенольных соединений на основе сбора из шести видов лекарственного растительного сырья при помощи горячей воды (80 90^o). Однако, в описанном способе в качестве экстрагента используется вода, которая извлекает из растительного сырья значительное количество сопутствующих веществ (липиды, протеины, углеводы и др.), не обладающие антисклеротической и желчегонной активностью.

Описан способ получения флавоноидов из семян расторопши пятнистой (Salybum marianum), заключающийся в том, что, с целью повышения чистоты целевого продукта, сырье кипятят с четыреххлористым углеродом, затем обрабатывают полярным растворителем, например, формамидом, смесь экстрагируют ацетоном или этилацетатом с последующим добавлением водного раствора хлорида натрия, из обработанной при этом двухфазной системы растворителей осаждают в воде целевой продукт после повторной экстракции этиленгликолем, содержащим хлорид кальция и, в случае необходимости, хроматографируют на колонке полиамида. Выход флавоноидов составляет 1,97% к исходному сырью. Полученный суммарный флавоноидный препарат из семян расторопши проявляет выраженное гепатозащитное и желчегонное действие. Продолжительность способа 45 ч (3). Указанный способ выбран нами за аналог.

Недостатками этого способа являются большая продолжительность (45 ч), трудоемкость и многостадийность, низкий выход целевого продукта (1,97%) и использование высокотоксичных и дорогостоящих растворителей и реагентов (четыреххлористый углерод, формамид, этилацетат, ацетон, этиленгликоль и др. ), ограниченные запасы сырья (используются только семена).

Известен способ получения суммы флавоноидов из травы клевера красного (Trifolium satiwum Crome) (4) путем экстрации растительного сырья 70 75% этанолом, при соотношении 1:(3 5). Очистку ведут последовательно хлороформом и этилацетатом с последующим осаждением сухим хлороформом целевого продукта. Выход составляет 3,83% в пересчете на воздушно-сухое исходное сырье. Продолжительность способа 25 ч. Полученный суммарный полифенольный препарат из травы клевера красного проявляет выраженную антисклеротическую активность (4). Указанный способ выбран нами за прототип.

Недостатками этого способа являются: большая продолжительность (25 ч) и трудоемкость, использование токсичных реагентов (хлороформ, этилацетат), значительные потери биологически активных действующих веществ в процессе получения и низкий выход целевого продукта (3,83%).

Целью изобретения является:
1. Повышение выхода целевого продукта;
2. Упрощение и сокращение продолжительности способа;
3. Исключение высокотоксичных реагентов;
4. Расширение спектра фармакологического действия;
5. Увеличение антисклеротической активности.

В заявляемом способе мы предлагаем использовать в качестве источника сырья траву клевера красного, собранную и высушенную теневым способом в период цветения. Клевер красный (посевной) повсеместно введен в культуру и его сырьевая база практически не ограничена. Имеется договоренность с МГО "ЮГАГРОКОНТ" (Краснодарский край) о заготовке и поставке сырья, а с Краснодарской фармацевтической фабрикой о производстве по предлагаемому способу субстанции суммарного полифенольного препарата из травы клевера красного, который под названием "Тризофлан" разрешен к клиническим испытаниям фармакологическим комитетом МЗ СССР в качестве антисклеротического и гиполипидемического средства.

Поставленная цель достигается тем, что способ получения из надземной части клевера красного (Trifolium sativum Crome) осуществляется экстракцией сырья 75 80% этанолом при соотношении сырье экстрагент 1:8 1:12 способом вихревой экстракции при скорости перемешивания 8000 об/мин в течение 10 мин с последующим фильтрованием экстракта. Далее шрот помещают в лабораторный реактор с мешалкой, заливают 75 80% этанолом при температуре 75 85^o при соотношении сырье экстрагент 1:8 12 и экстрагируют в течение 30 мин. Операцию повторяют трижды. Далее экстракты объединяют, фильтруют и упаривают под вакуумом до полного удаления спирта. Водный остаток охлаждают в холодильнике (до 5 ч при температуре 4^oC). Выпавший осадок липофильных веществ отделяют, фильтруют через пористую ткань на нутч-фильтре. Очищенный водный экстракт направляют в вакуум сушильный шкаф для получения сухого очищенного экстракта. Выход целевого продукта 14,5 15,3% Продолжительность способа 5 6 ч.

В заявляемом способе вихревая экстракция сырья осуществляется в приборе "Мельэкстрактор", где одновременно происходит два процесса: измельчение и экстракция; причем, благодаря наличию двух пар ножей, расположенных горизонтально и под углом 45^o к рабочей оси прибора, измельчение сырья идет по всем направлениям с разрывом клеточных стенок, что способствует дополнительно извлечению полифенолов не только из межклеточного, но и внутриклеточного сока, а следовательно, это способствует увеличению выхода целевого продукта. За счет высокой скорости перемешивания в максимально короткий срок наступает равновесие в системе сырье экстрагент, что значительно сокращает продолжительность технологических процессов.

Дальнейшее экстрагирование сырья в лабораторном экстракторе с мешалкой горячим этанолом трижды способствует максимальному извлечению полифенолов из сырья.

Исключение используемой в прототипе стадии экстракции полифенольных соединений этилацетатом и последующего осаждения полифенолов сухим хлороформом, значительно сокращает потери целевого продукта (3 4 раза).

Пример 1. 500 г растительного сырья (надземной части травы клевера красного) заливают 4,0 л 75% этанола (комнатной температуры) и перемешивают в приборе "Мельэкстрактор" при скорости вращения измельчающих ножей 6000 об/мин в течение 8 мин. Затем сырье фильтровали. Шрот после фильтрации переносят в лабораторный реактор с мешалкой, заливают 75% этанолом при температуре 75^o при соотношении сырье-экстрагент 1:8 и экстрагируют в течение 20 мин. Для более полного истощения шрот в лабораторном реакторе с мешалкой заливают еще дважды. Экстракты объединяют, фильтруют и упаривают под вакуумом до полного удаления спирта. Водный осадок помещают в холодильную камеру (4^oC) до 5 ч. Затем декантируют надосадочную жидкость, фильтруют через пористую ткань на нутч-фильтре и направляют в вакуум-сушильный шкаф для получения сухого очищенного экстракта. Выход целевого продукта 14,5% т.е. 72,5 на 500 г сырья. Общая продолжительность способа ≈7 ч.

Целевой продукт сумма полифенолов из травы клевера красного - представляет собой порошок темно-коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом, растворим в водном этаноле.

Пример 2. 500 г надземной части травы клевера красного заливают 5 л 80% этанола и перемешивают в приборе "Мельэкстрактор" при скорости вращения ножей 8000 об/мин в течение 10 мин. Затем экстракт фильтруют. Шрот переносят в лабораторный реактор с мешалкой и трижды заливают 80% этанолом при температуре 80^oC при соотношении сырье экстрагент 1:10 и трижды экстрагируют по 30 мин. Далее поступают, как описано в примере 1.

Выход целевого продукта составил 15,3% т.е. 76,5 г на 500 г сырья.

Пример 3. 500 г надземной части клевера красного заливают 6,0 л 80% этанола и перемешивают в приборе "Мельэкстрактор" при скорости вращения ножей 10000 об/мин в течение 15 мин. Затем экстрактор фильтруют. Шрот переносят в лабораторный реактор с мешалкой и трижды заливают 80% этанолом при температуре 85^o при соотношении сырье экстрагент 1:12 и трижды экстрагируют по 40 мин. Экстракты объединяют, фильтруют и упаривают до полного удаления спирта. Далее поступают, как описано в примере 1.

Выход целевого продукта составил 15,1% т.е. 75,5 г на 500 г сырья.

Примеры конкретного выполнения подтверждаются табл. 1 7.

Из табл. 1 следует, что оптимальным соотношением сырье экстрагент является предел 1:8 1:12, при этом обеспечивается наибольший выход целевого продукта.

Из табл. 2 следует, что оптимальной концентрацией экстрагента этилового спирта является 75 80% что обеспечивает наибольший выход полифенолов.

Из табл. 3 следует, что максимальный выход полифенолов обеспечивается при скорости вращения измельчающих ножей 8000 об/мин.

Из табл. 4 видно, что оптимальная продолжительность перемешивания, обеспечивающая максимальный выход полифенолов 10 мин.

Из табл. 5 видно, что максимальный выход полифенолов происходит при экстрагировании шрота этанолом при температуре 75 85^oC.

Из табл. 6 видно, что для полного извлечения полифенолов из сырья, шрот в лабораторном реакторе трижды заливают горячим этанолом и трижды собирают экстракты, которые в дальнейшем объединяют.

Как видно из табл. 7, в лабораторном реакторе сырье необходимо экстрагировать в течение 30 мин, что обеспечивает наибольший выход полифенолов.

Исследуя все таблицы, можно сделать вывод, что максимальный выход полифенолов будет происходить в том случае, если сырье залить 75 80% этанолом при соотношении 1: 8 12, экстрагировать методом вихревой экстракции в "Мельэкстракторе" при скорости перемешивания 8000 об/мин в течение 10 мин. А в лабораторном реакторе шрот заливают 75 80% этанолом при температуре 75 - 85^oC при соотношении сырье экстрагент 1:8 12 и экстрагируют трижды по 30 мин.

Выделенную сумму полифенольных соединений из травы клевера красного подвергали исследованию на фармакологическую активность (5,6,7).

Острая токсичность. Изучалась по методу Кербера (5) на белых мышах при внутрибрюшинном введении исследуемых соединений в объеме 1 мл водного раствора. Максимальная доза, возможная для введения, составила 6000 мг/кг массы тела животного, не вызывала гибели животных, что позволило считать LD₅₀ > 6000 мг/кг. Согласно классификации токсичности (по Сидорову К.К. 1973 г.) исследуемые соединения следует отнести к группе относительно безвредных веществ.

Основная специфическая антисклеротическая активность изучалась в сравнении с прототипом. В качестве стандарта при изучении антисклеротической и гиполипидемической активности использовали официальный препарат данного спектра действия "Мисклерон".

Биологические испытания препарата проводились на различных моделях: внутрибрюшинном введении тритона WR-1339, а также на холестериновой и эталоновой моделях. Сравнением служили интактные животные и животные, получившие препарат прототип и препарат стандарт.

Исследования проводились на крысах и кроликах. В результате испытаний установлено, что средство, полученное заявляемым способом, обладает выраженным гиполипидемическим и гипохолестеринемическим действием, превышающим действие препарата-прототипа на 15 20% Причем у препарата, полученного заявляемым способом, в 2 2,5 раза выше уровень снижения холестерина, β-липопротеидов и фосфолипидов, чем у препарата стандарта "Минсклерона" (данные приведены в табл. 8).

Для препарата, полученного предлагаемым способом из травы клевера красного, выявлена дополнительная специфическая желчегонная активность, не описанная для препарата прототипа.

Испытания на желчегонную активность проводились на белых крысах обоего пола массой 250 300 г. Согласно методике М.Д. Литвинчук (1980 г.) секреторную желчь собирали почасовыми порциями в течение 3 ч.

Препарат, полученный предлагаемым способом из травы клевера красного и эталонный препарат "Фламин" вводили в одинаковой дозе 50 мг/кг, как наиболее эффектный, в виде суспензии с добавлением нескольких капель Твина-80. Контрольная группа животных в аналогичных условиях получала дистиллированную воду с добавлением соответствующего количества твина-80.

В общей порции желчи определяли содержание желчных кислот, холестерина и рассчитывали холято-холестериновый коэффициент (В.П. Мирошниченко, 1978 г.). Данные представлены в табл. 9.

Анализ полученных данных показывает, что скорость секреции за 3 ч после введения препарата, полученного из травы клевера красного заявляемым способом увеличивалась на 40% (P < 0,05) по сравнению с контролем, что было в 1,2 раза выше действия официального эталонного препарата "Фламина". Препарат, полученный заявляемым способом, снижал содержание холестерина в желчи на 30% (P < 0,05) и желчных кислот на 21% (P < 0,05) по сравнению с контролем. Холято-холестериновый коэффициент был выше, чем в контроле на 99% (P < 0,01), что свидетельствовало об увеличении литогенности желчи.

Итак, заявляемый способ обеспечивает:
1. Значительное упрощение способа получения полифенолов. Он не требует дорогостоящих, высокотоксичных реактивов, прост в выполнении; исключает многостадийность. В то время, как в известном способе предлагается использовать токсичные для человеческого организма реактивы: хлороформ, этилацетат.

2. Продолжительность заявляемого способа составляет 5 6 ч, прототипного до 25 ч, т.е. продолжительность заявляемого способа в 5 раз меньше продолжительности известного способа.

3. Повышение выхода целевого продукта. В заявляемом способе выход полифенолов составляет 14,5 15,3% к исходному сырью, что в 4 5 раз превышает выход продукта в известном способе (3,83%).

4. Повышение активности целевого продукта и расширение спектра его фармакологического действия. Суммарный полифенольный препарат, полученный из травы клевера красного по заявляемому способу, превышает антисклеротическую активность аналогичного препарата, полученного по известному способу, на 15
20% и на 45 50% по сравнению с эталоном "Мисклероном". Кроме того, для предлагаемого препарата расширен спектр биологического действия выявлена желчегонная активность, которая превышает активность эталонного препарата "Фламина" в 1,2 раза.

Предложен новый способ получения средства, обладающего антисклеротической и желчегонной активностью. Сущность способа заключается в следующем: надземную часть травы клевера красного (Trilolium Sativum Crome) экстрагируют 75 - 80% этанолом при соотношении сырье - экстрагент 1:8 - 12 способом вихревой экстракции при скорости перемешивания 8000 об/мин в течение 10 мин с последующим фильтрованием. Затем шрот помещают в лабораторный реактор с мешалкой и экстрагируют 75 - 80% этанолом трижды по 30 мин при температуре 75 - 85^oC. Соотношение сырье - экстрагент 1:8 - 12. Экстракты объединяют, фильтруют и упаривают под вакуумом до полного удаления спирта. Затем охлаждают в холодильнике, выпавший осадок липофильных веществ отделяют, фильтруют, сушат в сушильном шкафу. Выход целевого продукта 14,5 - 15,3%. Продолжительность способа 5 - 6 ч.

Предлагаемый способ получения средства прост в выполнении, не требует дорогостоящих, высокотоксичных реактивов. Продолжительность заявляемого способа в 5 раз меньше. Выход целевого продукта увеличивается в 4 - 5 раз по сравнению с прототипом. Предлагаемый способ обеспечивает получение средства, обладающего более высокой антисклеротической активностью, чем средство, полученное по известному способу на 15 - 20%. Кроме того, выявлен новый вид биологической активности у средства, полученного предлагаемым способом - желчегонной, которая превышает активность эталонного препарата "Фламина" в 1,2 раза. 9 табл.

Способ получения средства, обладающего антисклеротической и желчегонной активностью, включающий экстракцию надземной части травы клевера красного (Trifolium sativum Crome) 75 80%-ным этанолом при соотношении сырье экстрагент 1 8 12 методом вихревой экстракции при скорости перемешивания 8000 мин^-1 в течение 10 мин, фильтрацию экстракта, экстракцию шрота при перемешивании 75 80%-ным этанолом трижды при 75 85^oС и при соотношении сырье экстрагент 1 8 12 в течение 30 мин, объединении экстрактов, их фильтрацию, упаривание, охлаждение и высушивание.