Способ получения эндо-N-ацетилмурамидазы и комплекса лизирующих ферментов Советский патент 1992 года по МПК C12N9/36 C12N1/20 

Изобретение относится к биохимии и ферментной промышленности, а именно к способу получения эндо-М-ацетилмурами- дазы и комплекса ферментов, лизирующих клетки бактерий, включая гемолитический стрептококк группы А.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения эндо-М-ацетилму- рамидазы и комплекса лизирующих ферментов с использованием актиномицета - продуцента - Stneptomyces levoris при выращивании на питательной среде, содержащей гидролизат казеина фирмы Difco (1). Недостатком данного способа является невысокий выход ферментов и использование в питательной среде дорогостоящего компонента - гидролизата казеина фирмы Difco, приобретаемого за валюту.

Целью настоящего изобретения являет- е я повышение выхода эндо-М-ацетилмура- мидазы с одновременным исключением из питательной среды гидролизата казеина фирмы Difco.

Цель достигается тем, что продуцент S.levoris выращивают глубинным способом при температуре 26-28 в течение 56-70 часов после инокуляций колб 2-суточным ве- геШтйвным м ицелиём в количестве 5 об.% на ферментационной среде, содержащей (%): кукурузный экстракт - 0,8-1,2 (по сырому весу), натрий хлористый - 0,4-0.6; глюкоза - по 0,2 ± 0,05 через каждые 20-24 часа ферментации; аммоний сернокислый - 0,3- 0,4; мел технический - 0,4-0,5; крахмал картофельный - 0,5-0,6. рН среды 7,4-7,8 (доводится 0,1 N NaOH). При этом достига 4СО

д

(О

ю о

ется повышение выхода и удельной активности целевых продуктов. Из 50 л культу- ральной жидкости получают 1814 мг препарата эндо-ацетилмурамидазы с удельной литической активностью 580 Е/мг белка и 2350 мг препарата, содержащего комплекс лидирующих ферментов с удельной литической и протеолитической активностью- 850 Е/мг белка и 1130 Е/мг белка соответственно

Внесение в ферментационную среду кукурузного экстракта ниже 0,8% приводит к замедлению накопления биомассы продуцента и, как следствие, удлинению процесса ферментации. Увеличение в среде кукурузного экстракта выше 1,2% не приводит к увеличению выхода ферментов. Снижение концентрации хлористого натрия ниже 0,4% и увеличение его концентрации выше 0,6% приводит к появлению крупнозернистых микроколоний, удельная активность которых ниже по сравнению с нормальными хлопьеобразными микроколониями. При добавлении в среду аммония сернокислого ниже 0,3% не обеспечивает достаточного азотного питания продуцента, а увеличение ее выше 0,4% не отражается на росте и активности продуцента. Снижение Концентрации мела технического ниже 0,4% не обеспечивает в полной мере естественную регуляцию рН среды, а повышение ее свыше 0,5% ингибирует активность фермента. При снижении концентрации крахмала картофельного ниже 0.4% наблюдается уменьшение выхода биомассы, а при увеличении концентрации крахмала выше 0,6%, часть его остается неиспользованной продуцентом. Наконец, дробная подача глюкозы по 0,2% через каждые сутки ферментации предотвращает катаболитную репрессию синтеза ферментов, что способствует максимальному накоплению последних в культуральной жидкости.

Таким образом, отличительными признаками данного способа является то, что культивирование проводят на питательной среде следующего состава (%): кукурузный экстракт - 0,8-1,0 (по сырому весу); натрий хлористый - 0,4-0,6; глюкоза - 0,4-0,6 (по 0,2 каждые сутки); аммоний сернокислый - 0,3-0,4; мел технический - 0,4-0,5; крахмал картофельный - 0,5-0,6; при рН 7,4-7,8 в течение 56-70 ч с последующим выделением ферментов.

П р и м е р 1. Культуру S.levoris 96 выращивают в 20 конических колбах емкостью 1000 мл, заполненных 250 мл жидкой ферментационной среды следующего состава (%): кукурузный экстракт- 0,8; натрий хлористый - 0,4; сульфат аммония - 0,3;

технический мел - 0,4; картофельный крахмал - 0,5, глюкоза - 0,2 и по ходу ферментации вносятся через каждые 24 часа по 0,2%; рН среды 7,8; стерилизация при 0,8 атм 30

мин. Колбы инокулируют 5% (по объему) двухсуточного вегетативного мицелия S.levoris 96, выращенного на той же среде глубинным способом. Ферментацию ведут на круговой качалке, скорость вращения которой составляет 220 об/мин, при температуре 26°С в течение 70 часов. При этом каждые сутки вносят по 2 г/л глюкозы в процессе ферментации - до 6 г/л. Полученную культуральную жидкость освобождают

от мицелия центрифугированием (7000 д, 15 мин, 4°). Из полученного нативного раствора осаждают ферменты сульфатом аммония при насыщения 70% в течение 10 часов при 4 . Осадок собирают на центрифуге Heraeus

Christ (10000 g, 10 мин, 4°), растворяют в 100 мл 0,002 М калийфосфатного буфера рН 8,0 и обессоливают гельфильтрацией на колонке (3,5 х 100 см), заполненной сефадексом Г-25 (грубый). Затем раствор ферментов наносят на колонку (3,5 х 60 см) с ДЭАЭ-цел- люлозой, уравновешенную 0,002 М калийфосфатным буфером, рН 8,0. Элюцию проводят тем же буфером со скоростью 30 мл/ч. Получают фракцию, которая не сорбируется на ДЭАЭ-целлюлозе, и наносят ее на колонку (3,0 х 60 см) с КМ-целлюлозой, предварительно уравновешенную 0,002 М калийфосфатным буфером. Элюцию проводят со скоростью 20 мл/ч. Белок, элюированный с колонки исходным буфером (0,002 М), представляет собой комплекс литиче- ских ферментов с удельной литической активностью 750 Е/мг белка (за единицу активности принимают изменение оптической плотности суспензии клеточных стенок стрептококка группы А тмг 29М при длине волны 650 нм на 0,001 на 1 минуту при температуре 37°) и с удельной протеолитической активностью 1200 Е/мг белка (за

единицу активности принимают изменение оптической плотности 0,5 х 10 М раствора М-бензоил-Ь-аргинин этилового эфира при длине волны 253 нм на 0,001 на 1 минуту при температуре 37°). Перед элюцией фермента

эндо-Г 1-ацетилмурамидазы колонку промывают 0,04 М калий-фосфатным буфером рН 8,0. Белок, элюированный с колонки 0,08 М калий-фосфатным буфером рН 8,0, является эндо-М-ацетилмурамидазой с удельной литической активностью 550 Е/мг белка. Ферментный препарат не содержит протеаэ

В результате очистки из 5 литров культуральной жидкости получают 170 мг препа- рата эндо-М-ацетилмурамидазы с удельной

литической активностью 550 Е/мг белка и 220 мг препарата, содержащего комплекс литических ферментов с удельной литической и протеолитической активностью 750 и 1200 Е/мг белка соответственно.

П р и м е р 2. Продуцент S.levoris 96 культивируют в 100-литровом ферментере. В качестве посевного материала используют 48-часовую глубинную культуру S.levoris 96 в количестве 5% от объема питательной среды. Для глубинного культивирования продуцента используют среду, содержащую (%): кукурузный экстракт -1.2 (по сырому весу), натрий хлористый - 0,6. глюкоза - 0,2 и по ходу ферментации вносится по 0,2% через каждые 24 ч, аммоний сернокислый - 0,4, мел технический - 0,5, крахмал картофельный - 0,6, рН среды 7.4. Готовят в ферментере 50 л питательной среды, которую стерилизуют при давлении 1 атм в течение 30 мин. Перед посевом добавляют 0,15 л подролнечного масла в качестве пеногаси- теля. Ферментацию ведут в течение 56 часов при температуре 28°. Скорость вращения мешалки 250 об/мин, аэрация: 1 объем воздуха/ 1 объем среды/мин.

Культуральную жидкость освобождают от мицелия сепарированием. Мицелий отбрасывают. Из оставшегося нативного раствора высаливают белки сульфатом аммония, который вносят в нативный раствор постепенно при перемешивании до конечной концентрации 70% и оставляют на 10 часов при температуре 4°. Недостаточную жидкость декантируют, оставшийся рыхлый осадок центрифугируют при 10000 g в течение 20 мин при температуре 4°С. Полученный плотный осадок растворяют в 1 литре, 0,002 М калий-фосфатного буфера рН

8.0и проводят в диализ против этого же буфера. После диализа 1/4 часть раствора белков наносят на колонку (3,5-100 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную 0,002 М калий-фосфатным буфером, рН 8,0. Полученную первую фракцию нанрсят на колонку (3,5 х 60 см) с Ш-целлюлозой, предварительно уравновешенную 0,002 М калий-фосфатным буфером. Белок, элюиро- ванный исходным буфером, представляет собой комплекс литических ферментов. Перед элюцией фермента эндо-Ы-ацетилмура- мидазы колонку промывают 0,04 М калий-фосфатным буфером рН 8,0. Фермент эндоацетилмурамидазы элюируют 0,08 М калий-фосфатным буфером рН 8,0.

Очистку 3/4 частей ферментного препарата, полученного после диализа, проводят по схеме, приведенной в примере 1. Из 50 литров культуральной жидкости получают

2.1г препарата, содержащего комплекс литических ферментов с удельной литической и протеолической активностью - 900 и 1050 Е/мг белка соответственно, и получают 1,55 г ферментного препарата эндо-М-ацетилмурамидазы с удельной литической активностью - 480 Е/мг белка.

Способность синтезировать эндо-М- ацетилмурамидазу определяли также у ряда других штаммов Streptomyces levorfs, для

чего был использован специфический субстрат данного фермента - клеточные стенки Streptococcus pyogenes, группы А. Клеточные стенки получали по (3) путем разрушения клеток стрептококка на экструзионном

прессе, с последующей отмывкой и отделением от клеточных мембран дифференциальным центрифугированием.

П р и м е р 3. Культуру S.levoris K-4021 выращивают в конических колбах, емкостью

250 мл, содержащих по 50 мл жидкой питательной среды следующего состава (%): кукурузный экстракт - 1 (по сырому весу), натрий хлористый - 0,5, глюкоза - 1, аммоний сернокислый - 0,35. мел технический 0,5, крахмал - 1,5; рН 7,8. В качестве иноку- лята используют 2-х суточный вегетативный мицелий в количестве 5 % об., выращенный на этой же среде глубинным способом. Ферментацию ведут на круговой качалке (220

об/мин) при температуре 26°С в течение 70 часов. Культуральную жидкость освобождают от мицелия центрифугированием (7000 g, 15 мин). В нативном растворе определяют эндо-М-ацетилмурамидазную активность.

Для этого отбирают 2 мл нативного раствора, куда добавляют 1 мл суспензии клеточных стенок стрептококка в 0,075 М фосфатном буфере. Активность определяют турбидиметрическим методом (2) на спектрометре при длине волны 650 нм и выражают в процентах уменьшения оптической плотности суспензии клеточных стенок через 60 мин при температуре 37°С. Активность эндо-М-ацетилмурамидазы S.levoris

К-4020 составляет 83 %.

П р и м е р 4. Используют культуру S.levoris K-3326. Условия выращивания и определения эндо-М-ацетилмурамидазной активности как в примере 3, которая составляет для штамма S.levoris K-3326 - 72%.

П р и м е р 5. Используют культуру S.levoris К-3549. Остальное, как в примере 3. Ацетилмурамидазная активность штамма S.levoris K-3549 составляет 89%.

Примерб. Используют культуру

SJevorls 96. Остальное - как в примере 3.

Лизис клеточных стенок стрептококка (ацетилмурамидазная активность) составляет

93%.

Установлено, что: 1) способность синтезировать эндо-М-ацетилмурамидазу присуща тем испытанным штаммам вида Streptomyces levorls,2) применение заявляемого изобретения позволяет увеличить выход препарата эндо-М-ацетилмурамидазы в 15-17 раз по сравнению с прототипом, а также повысить удельную активность в 3-4 раза. Увеличивается также количество ферментного препарата, содержащего комплекс литических ферментов, в 4-5 раз, а его удельная литическая активность повышается в 8-10 раз. Кроме этого, упрощается метод очистки ферментов на Ш-целлюлозе за счет отсутствия в ферментном препарате, элюированном с ДЭАЭ-целлюлозы, балластных белков ; 3) используемая питательная среда не содержит дорогостоящего гидро- лизата казеина фирмы 0 тсо/получаемого из пищевого продукта - коровьего молока. Формула изобретения Способ получения зндо-М-ацетилмура- мидазы и комплекса лизирующих ферментов, предусматривающий культивирование продуцирующего штамма Streptomyces levorls 96 на жидкой питательной среде, содержащей источник углерода, азота, глюкозу и натрий хлористый с последующим выделением ферментов,отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода и удельной активности целевых продуктов, а также упрощения выделения эндоN-ацетилмурамидазы, в состав жидкой питательной среды дополнительно вводят мел технический в количестве 0,4-0,5 мас.%, аммоний сернокислый 0,3-0,4 мас.%, в качестве источника углерода используют крахмал картофельный 0,5-0,6 мас.%, источника азота-кукурузный экстракт в количестве 0,8-1,2 мас.%, по сырой массе, при этом глюкозу вводят дробно равной порцией через каждые

сутки до достижения концентрации в среде 0,4-0.6 мас.%, устанавливая рН среды 7,4-7,8 и продолжительность культивирования 56-70 ч.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: для культивирования продуцента используют среду, содержащую (%) кукурузный экстракт 0,8-1,2; натрий хлористый 0,4-0,6; глюкоза 0,4-0,6 (дробная подача); аммоний сернокислый 0,3-0,4; мел технический 0,4-0,5; крахмал картофельный 0,5-0,6; рН 7,4-7,8. Выращивание Streptomyces levoris проводят глубинным способом при 26-28°С в течение 56-70 ч с последующим выделением ферментов. При использовании способа упрощается выделение эндо-М-ацетилмурамидззы, увеличивается выход ферментных препаратов: эндо- М-ацетилмурамидазы в 15-17 раз, а комплекса лизирующих ферментов - 4-5 раз. Соответственно в 3-4 раза и 8-10 раз увеличивается удельная литическая активность указанных препаратов. сл