СПОСОБ ОЦЕНКИ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2001 года по МПК G01N33/53 

Известны методы исследования иммуномодулирующего эффекта препаратов на различные показатели иммунной системы. При изучении иммуномодулирующей активности обязательным является использование интегральных тестов, позволяющих оценить действие изучаемого фактора на систему в целом. К ним относятся такие тесты как чувствительность к различным бактериальным и вирусным инфекциям и интоксикациям (1). Все эти методы основаны на сравнении изучаемого показателя в опытной группе (после введения иммуномодулятора) и контрольной группе. Результаты выражаются в относительных единицах (в% к контролю или в дельте - разности между опытной и контрольной группами).

Уровень изучаемого показателя у интактных животных имеет значение в определении направленности и выраженности иммуномодулирующего эффекта (2). Иммуномодулирующий эффект зависит от фазы биоритма изучаемого показателя у контрольных животных. (Фаза биоритма - точка на кривой биоритма изучаемого показателя у контрольных животных, на которую приходится момент исследования. ).

Однако методы основаны на регистрации показателей один раз в сутки, характер изменения уровня изучаемого показателя у интактных животных в ходе эксперимента не учитывается. Дифференциация специфического и неспецифического компонента иммуномодулирующего эффекта этими методами не проводится.

Целью изобретения является повышение информативности и точности оценки иммуномодулирующей активности препаратов и различных воздействий, дифференциация специфического и неспецифического компонента иммуномодулирующего эффекта.

Сущность способа заключается в определении иммуномодулирующей активности препарата в различные фазы биологического ритма и дифференцировки специфического и неспецифического компонентов иммуномодулирующего эффекта.

Неспецифические изменения - это однотипные стандартные изменения, возникающие в ответ на действие различных по качеству раздражителей. Специфические изменения - это свои, особые, присущие только данному воздействию свойства.

Иммуномодулирующая активность препарата определяется не по изменению уровня изучаемого показателя относительно контроля, а по характеру изменения его биоритма под влиянием иммуномодулятора. Иммуномодулирующую активность определяют по феномену стягивания. В результате иммуномодулирующего воздействия происходит стягивание изучаемого показателя в зону средних значений. (Зона средних значений - диапазон близких к медиане значений физиологических параметров, вхождение в который обеспечивает максимум приспособления организма к различным воздействиям).

Определение и оценка неспецифического компонента иммуномодулирующего эффекта проводятся в точках биоритма, расположенных выше и ниже зоны средних значений (оптимально - в момент акрофазы и батифазы, то есть в момент наибольшего подъема или спада уровня изучаемого показателя у интактных животных). Поэтому обязательным является знание особенностей суточного биоритма изучаемого показателя у контрольных животных.

Специфический компонент иммуномодулирующего эффекта препарата определяется в момент исследования, когда уровень изучаемого показателя у контрольных животных находится в зоне средних значений и оценивается по изменению уровня изучаемого показателя относительно контроля в относительных единицах (точка N 1 на фиг 1.1)
Пример
Для определения иммуномодулирующей активности сальмозана (СМ) и фосфпренила препараты вводят подкожно мышам линии BALB/C в 12.00, 18.00, 24 и 6.00 часов, что соответствует первой, второй, третьей и четвертой опытным группам. Иммуномодулирующую активность препарата определяют по изменению уровня активности 5-нуклеотидазы (5-н) макрофагов перитонеального экссудата МПЭ (3). Ферментативную активность определяют через 6 часов после введения сальмозана и фосфпренила в дозах 100 и 4 мкг соответственно.

На фиг. 1 показаны уровни активности 5-н у интактных животных (фиг. 1.1) и после введения сальмозана (фиг. 1.2) и фоспренила (PP) (фиг. 1.3) в абсолютных единицах (мкг фосфора на 10⁶ кл.).

Для оценки неспецифического компонента иммуномодулирующей активности препаратов выбраны три опытные группы (вторая, третья и четвертая), что соответствует времени введения препаратов в 18.00, 24.00 и 6.00 часов (время исследования - 24.00, 6.00 и 12.00 часов соответственно). В этих группах время исследования приходится на тот момент, когда уровень активности 5-н у интактных животных находится в точках биоритма, расположенных ниже и выше зоны средних значений (точки N 2, 3 и 4 на фиг. 1.1).

Оценку неспецифических свойств иммуномодулирующего эффекта определяют по феномену стягивания и выражают в КСК (коэффициент стягивания относительно контроля) и КСОФ (коэффициент стягивания относительно физиологического раствора).

На первом начальном этапе, этапе скрининга, устанавливают наличие феномена стягивания путем вычисления КСК. Феномен стягивания определяют при сравнении биоритма изучаемого показателя у интактных животных (фиг. 1.1) и у животных после введения иммуномодулятора (фиг. 1.2 и фиг. 1.3). Феномен стягивания сопровождается уменьшением амплитуды суточных колебаний изучаемого показателя у опытных животных (N 6 фиг. 1.2 и N 7 фиг. 1.3) по сравнению с амплитудой 5-н у интактных животных (N 5 фиг. 1.1).

Амплитуду биоритма 5-н у интактных животных принимают за 1. КСК вычисляют путем деления амплитуды биоритма 5-н опытных животных на амплитуду 5-н у контрольных животных. При наличии феномена стягивания КСК меньше единицы.

По величине КСК можно судить о неспецифических свойствах иммуномодулирующего эффекта. Чем меньше величина КСК, тем сильнее проявление неспецифических свойств изучаемого препарата.

В данном случае амплитуда суточных колебаний уровня активности 5-н у контрольных животных равна 976, при введении сальмозана - 105, при введении фоспренила - 528. КСК равен при введении сальмозана - 0,108, при введении фоспренила - 0,54.

Таким образом, установлено, что введение сальмозана и фоспренила во все сроки исследования вызывает стягивание изучаемого показателя в зону средних значений. Действие препаратов не зависит от времени введения, оно однотипно во всех опытных группах и характеризуется выраженными неспецифическими свойствами обоих препаратов. Вычисление КСК показывает, что у сальмозана проявление неспецифических свойств почти в 5 раз сильнее, чем у фоспренила.

Однако КСК является показателем, который позволяет дать лишь предварительную оценку неспецифических свойств иммуномодулирующего эффекта, так как за эталон принята амплитуда биоритма изучаемого показателя у контрольных животных, величина непостоянная, которая может меняться от опыта к опыту.

КСК вычисляют в следующих случаях:
1. Для установления наличия феномена стягивания на этапе скрининга иммуномодулирующих препаратов.

2. При сравнении неспецифических свойств иммуномодулирующих препаратов, исследование которых проводится одномоментно при одном и том же контроле.

3. В тех случаях, когда по тем или иным причинам КСОФ не может быть вычислен. При этом необходимо помнить, что оценка неспецифических свойств препарата по КСК может быть занижена.

На втором этапе оценки неспецифического компонента иммуномодулирующего эффекта препарата вычисляют КСОФ. Преимущество данного коэффициента по сравнению с КСК заключается в том, что эталоном для вычисления КСОФ является зона стягивания после внутрибрюшинного введения физиологического раствора - величина постоянная для каждого изучаемого показателя.

Для определения КСОФ определяют зону стягивания у опытных животных (после введения сальмозана - фиг.2.2 N 2, фоспренила - фиг. 2.3 N 3) и у контрольных животных через 20 мин после введения физиологического раствора (фиг. 2.1 N 1). Зону стягивания определяют в абсолютных единицах с учетом доверительных интервалов (величину верхней границы зоны увеличивают, нижней - уменьшают на величину доверительного интервала). Зона стягивания после внутрибрюшинного введения физиологического раствора (фиг. 2.1 N 1) является эталоном для определения КСОФ, ее принимают за 1. КСОФ вычисляют путем деления зоны стягивания у эталонных животных на зону стягивания у опытных. Если различия между исследуемыми показателями у опытных и эталонных животных незначимы, то КСОФ принимают за 1. Чем меньше КСОФ, тем слабее проявление неспецифических свойств препарата.

Для вычисления КСОФ при введении сальмозана и фосфпренила выбраны две опытные группы - вторая и третья, что соответствует времени введения препарата в 18.00 и 24.00 (срок исследования - в 24.00 и 6.00 часов). В этих группах время исследования приходится на момент наибольшего подъема и спада уровня активности 5-н у интактных животных (точка N 2 и N 3 на фиг. 1.1).

На фиг. 2 представлены уровни активности 5-н во второй и третьей группе после введения физиологического раствора за 20 мин до исследования (фиг. 2.1) и через 6 часов после введения сальмозана (фиг. 2.2) и фоспренила (фиг. 2.3). Зону стягивания определяют при сравнении уровня активности 5-н в этих двух группах.

Зону стягивания после введения физиологического раствора (фиг. 2.1) определяют по значениям уровня активности 5-н в 24.00 - 610 ± 30 (N 4) и в 6.00 - 623 ± 37 (N 5). Зона стягивания (N 1) с учетом доверительных интервалов располагается между значениями ферментативной активности - 580 и 660 и = 80.

Зону стягивания после введения сальмозана (фиг. 2.2) определяют по значениям уровня активности 5-н в 24.00 - 590 ± 26 (N 6) и в 6.00 - 670 ± 54 (N 5). Зона стягивания (N 2) с учетом доверительных интервалов располагается между значениями ферментативной активности - 564 и 724 и = 160.

Зону стягивания после введения фоспренила (фиг. 2.3) определяют по значениям уровня активности 5-н в 24.00 - 393 ± 33 (N 8) и в 6.00 - 921 ± 45 (N 9). Зона стягивания (N 3) с учетом доверительных интервалов располагается между значениями ферментативной активности - 607 и 967 и = 360.

КСОФ вычисляют путем деления зоны стягивания после введения физиологического раствора на зону стягивания после введения препарата.

При введении сальмозана КСОФ принимают за 1,0, так как различия между исследуемыми показателями в опытных группах и в группах после введения физиологического раствора статистически незначимы (P < 0,05).

При введении фосфпренила КСОФ = 80 : 360 = 0,22.

Таким образом, вычисление КСОФ также показывает, что проявление неспецифических свойств иммуномодулирующего эффекта выражено в большей степени у сальмозана, чем у фоспренила (в 4,6 раза).

Оценку специфического компонента иммуномодулирующей активности препаратов проводят в первой опытной группе при времени введения препаратов в 12.00 часов (время исследования - 18.00 часов). В этой группе время исследования приходится на тот момент, когда уровень активности 5-н у интактных животных находится в точке биоритма, расположенной в зоне средних значений (точка N 1 на фиг. 1.1). Уровень ферментативной активности определяют после введения иммуномодуляторов и через 20 минут после внутрибрюшинного введения физиологического раствора. Группа физиологического раствора является эталоном, по которому контролируют нахождение уровня изучаемого показателя у контрольных животных в момент исследования в зоне средних значений. При выполнении данного условия введение физиологического раствора не вызывает изменения изучаемого показателя.

На фиг. 3 показано изменение уровня ферментативной активности после введения физиологического раствора (N 1), сальмозана (N 2), фоспренила (N 3). Введение физиологического раствора не вызывает изменения уровня активности 5-н. Введение обоих препаратов сопровождается увеличением уровня ферментативной активности. При применении фоспренила повышение уровня активности 5-н при введении фоспренила выражено в большей степени, чем при введении сальмозана (более чем в 6 раз).

Таким образом, сравнительная оценка иммуномодулирующей активности сальмозана и фоспренила амплитудно-биоритмологическим способом показала, что уже через 6 часов после подкожного введения сальмозана и фоспренила мышам линии Balb/C в дозе 100 и 4 мкг соответственно наблюдается значительное изменение уровня активности 5-н, что свидетельствует о наличии иммуномодулирующего эффекта. Действие обоих препаратов не зависит от времени введения, сопровождаясь во все сроки стягиванием изучаемого показателя в зону средних значений. В механизме действия обоих препаратов имеет место как неспецифический, так и специфический компонент иммуномодулирующего эффекта. Неспецифические свойства в большей степени выражены у сальмозана, чем у фоспренила, специфические, напротив, в большей степени - у фоспренила. Можно сделать заключение, что у сальмозана иммуномодулирующий эффект в основном связан с неспецифическим, у фоспренила, напротив, - со специфическим компонентом иммуномодулирующего эффекта.

Оценка полученных результатов известным методом, в основе которого лежит сравнение опытных данных с уровнем изучаемого показателя у контрольных животных, приводит к совершенно иным выводам относительно иммуномодулирующей активности сальмозана и фоспренила. Так, сравнение опытных результатов после введения сальмозана в первой и второй группах (введение препарата в 12 и 18 часов), выраженных в относительных единицах, показывает, что действие препарата при введении в 12.00 и 18.00 совершенно однотипно и проявляется в повышении уровня активности 5-н на 142.7 ± 21 и 153 ± 19 ед. относительно контрольного уровня. Амплитудно-биоритмологический способ доказывает, что действие сальмозана при введении в 12.00 и 18.00 часов не только вызывает различное изменение уровня активности 5-н, но является результатом проявления различных сторон иммуномодулирующего эффекта. В первой опытной группе изменение ферментативной активности является проявлением специфических свойств препарата, во второй, напротив, - неспецифических. Дифференциация специфического и неспецифического компонента известными методами оценки иммуномодулирующей активности не проводится.

На фиг. 4 представлены результаты, которые доказывают, что оценка неспецифического компонента иммуномодулирующего эффекта двумя сравниваемыми способами также носит различный характер. На фигуре представлены результаты влияния сальмозана (фиг.4.1) и фоспренила (фиг. 4.2) на активность 5-н, выраженные в относительных единицах. Сравниваются результаты во второй, третьей и четвертой группах, отличающихся временем введения препарата. Видно, что изменение аткивности 5-н относительно контроля при введении обоих препаратов зависит от времени введения в течение суток. Эта зависимость наиболее ярко проявляется при введении сальмозана. Так, при введении сальмозана в 18.00 часов отмечено повышение ферментативной активности, в 24.00 и 6.00 - различное по степени выраженности снижение. Оценка амплитудно-биоритмологическим способом показывает, что во все сроки исследования происходит стягивание изучаемых показателей в зону средних значений (фиг. 1.2 и 1.3).

Правомочность амплитудно-биоритмологического способа оценки иммуномодулирующего эффекта по феномену стягивания, его преимущество и информативность наиболее убедительно видна при сравнении результатов повторных экспериментов, которые при оценке известным методом (фиг. 5 N 3) попали в разряд неповторяемых. На фиг. 5 представлены результаты повторных опытов по влиянию сальмозана на чувствительность к чумной интоксикации (фиг. 5.1) и стафилококкового энтеротоксина A на чувствительность к заражению стафилококковой инфекцией (рис 5.2). Из фигуры видно, что при оценке по феномену стягивания (N 2) исчезают все противоречия между результатами повторных экспериментов. Оценка иммуномодулирующей активности препаратов во всех повторных опытах носит совершенно аналогичный характер (феномен стягивания выявляется при сравнении N 1 и N 2 на фиг 5.1 и 5.2)
Таким образом, амплитудно-биоритмологический способ позволяет дифференцировать неспецифический и специфический компонент иммуномодулярующего эффекта. Этот способ повышает информативность и точность методов оценки и отбора иммуномодуляторов. Применение этого метода показывает, что проблема вариабельности и неповторяемости оценки иммуномодуляторов является чисто методологической и легко устраняется при изучении действия иммуномодуляторов с применением биоритмологического подхода.

Список литературы
1. Петров Р. В. Методические рекомендации по отбору иммуномодулирующих препаратов.// Москва. - 1997 г.

2. Кирилличева Г.Б., Соловьева М.С., Батурина И.Г, Пронин А.В., Туманян М. А. //Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 1997. - т. 124. - N 12. - с. 658-662.

3. Кирилличева Г.Б., Соловьева М.С., Батурина И.Г, Туманян М.А. // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 1993. - т. 115. - N 5. - c. 642-645.

Изобретение относится к медицине, иммунологии, к способам первичного отбора и оценки иммуномодулирующей активности препаратов. Способ заключается в определении иммуномодулирующей активности препарата в различные фазы биологического ритма и дифференцировки специфического и неспецифического компонентов иммуномодулирующего эффекта. Иммуномодулирующую активность определяют по феномену стягивания. Способ позволяет повысить информативность и точность методов оценки и отбора иммуномодуляторов. 5 ил.

Способ оценки иммуномодулирующей активности препаратов, включающий сравнение уровня анализируемого показателя у контрольных и опытных животных, отличающийся тем, что уровень анализируемого показателя определяют в разные фазы биоритма и проводят дифференцировку специфического и неспецифического компонента иммуномодулирующего эффекта, оценивая последний по феномену стягивания.