СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ЭУБИОТИКА КОЛИБАКТЕРИН Российский патент 2001 года по МПК A61K35/74 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения биологически активных препаратов из микробов-антагонистов.

Существуют препараты на основе микробов-антагонистов, объединенных под общим названием эубиотики. Это широко известные и применяемые препараты - колибактерин, лактобактерин, бификол, бифидумбактерин и др. В настоящее время получают признание комплексные - поликомпонентные биопрепараты, включающие как несколько видов микроорганизмов, так и различные вещества с защитным или стимулирующим свойствами (Иммунобиологические препараты. Сб. науч. трудов. Московский НИИ Эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского. - Москва - 1989 г.). Все эти препараты выпускают лиофильно высушенными, что продлевает их срок хранения и улучшает возможность доставки потребителю (Громова О. А., Антибиотики и эубиотики / Под ред. С.А.Лебедевой. - Иваново, 1991 г.).

Известно, что часть лиофильно высушенной культуры кишечной палочки из состава препарата колибактерин гибнет, не обладая возможностью восстановить способности к репаративным процессам. Перевод этой части популяции бактериальных клеток к активной пролиферации способен усилить действие препарата и уменьшить риск потери активности препарата. Увеличение количества жизнеспособных клеток в составе препарата будет способствовать успешному преодолению естественных барьеров теплокровного организма (желудочный сок, желчь, ферменты пищеварительного сока), которые также могут негативно воздействовать на степень активности препарата. Поэтому создаются комплексные бактерийные препараты, способствующие повышению количества активного действующего начала препарата-эубиотика (Пинегин Б.В., Мальцев В.Н., Коршунов В.М. Дисбактериозы кишечника. - М.: Медицина, 1984 г.).

Существует стандартная методика получения препаратов эубиотиков: клетки выращивают в достаточном объеме (не менее 10⁸/мл), отделяют от жидкой среды центрифугированием, затем суспендируют осадок в стерильном криопротекторе (20% снятое молоко или 24% раствор сахарозы, 10% декстран и т.д). Суспензию бактерий наливают в ампулы. Ампулы замораживают в течение часа при температуре t = 60-65^oC, затем высушивают в вакууме 2-3•10^-2 мм рт.ст. в течение 18 часов. По окончании высушивания ампулы запаивают (Методы общей бактериологии T1/Под ред. Ф. Герхардта. - М.: Мир, 1983 г.). Известны способы получения комплексных бактерийных препаратов. Так, предложен способ получения эубиотика - биоспорина - заявка N 96123690/13 от 18.12.96 6 А 61 К 35/74. Поберий И. А., Харченко А.Т., Кузнецов В.В., Филин В.А., Доронин А.Н., Смирнов В.В., Сорокулова И.Б., где авторы предлагают получать глубинные нативные или концентрированные культуры эубиотиков (Bacillus subtilis и В. licheniformis) стабилизировать культуру сухим обезжиренным молоком, сахарозо-желатиновой защитной средой с последующей лиофилизацией в ампулах. Предложены также способы соединения микроорганизма с основой (патент N 2017486 Григорьев А.В. 1994 г. (5 А 61 К 31/00) "Способ получения комплексного бактерийного препарата"), где в качестве основы предлагается использовать активированный уголь в виде порошка с размером частиц 30 мкм, или использование лактозы в качестве стимулятора (патент на изобретение N 2123343 (БИ N 16, ч.1, с. 34 Алин Б.И., Красильникова О.Б., Ворончихин А.А., Ким Г.Б., Чупринина Р.П., 1998 г. ).

Наиболее близким к заявляемому способу, выбранным нами в качестве прототипа, является способ получения колибактерина (Руководство по вакцинному и сывороточному делу /Бургасов П.Н.; М., Медицина, 1978). Данный способ предусматривает следующие этапы в технологии получения препарата "Колибактерин":
1. Получение биомассы Е. Coli.

2. Добавление защитной среды.

3. Расфасовка в стерильные ампулы.

4. Лиофильная сушка.

Однако препарат, получаемый при использовании данной технологии, отличается довольно низким выходом биомассы Е. coli, поэтому мы предлагаем способ получения активного препарата колибактерин, где в качестве стимулятора выступает натуральный сок высшего съедобного гриба Шии-таке (Lentinus edodes). Шии-таке (Lentinus edodes) - высший съедобный гриб, относящийся к классу Basidiomycetes культивируется в мире в промышленных масштабах (Псурцева Н.В. , Белова Н. В. Биотехнология, 1994. - N 7. - с.35-39). Данный гриб используется в качестве основы лекарственных препаратов, обладающих карциностатическим, противоэкзэматозным действием (Патент Японии (IP) N 60-23392). Известно противоопухолевое действие препаратов мицелия и питательной среды, в которой выращивали мицелий гриба (ЕПВ Европейский патент N 0088151). Кроме того, в медицине базидиальные грибы используются как продуценты антибиотических субстанций. Особо заслуживает внимания обнаруженный факт, что наблюдается вирицидная активность и в отношении ретровирусов (СПИД). Активные вещества высших базидиальных грибов представлены терпенойдами, пуринами, хинонами, пиримидинами, производными фенолов (Феофилова Е.П. Прикладная биохимия и микробиология, 1998, том 34, N 2. - с. 131-138).

Данные о биологически активных компонентах, содержащихся в грибах Lentinus edodes - Шии-таке, представлены в сборнике научных трудов "Окружающая среда и здоровье человека", Иваново, 1998 г. Биокомпоненты гриба Шии-таке обнаруживают иммуномодулирующее действие (Immunopotentiating activity of the water-soluble lignin rich fraction prepared from LEM - the extract of the solid culture medium of Lentinus edodes mycelia. / Yamamoto Y., Shirono H., Kono K., Ohashi Y.//Biotechnol Biochem. - 1997. - Vol. 61, N11. - P. 1909-1912; Wang GL, Lin ZB The immunomodulatory effect of lentinan. // Yao Hsueh Hsueh Pao 1996. - N2, Vol. 31. -P. 86-90; An in vivo study of hepatic and splenic interleukin-1 beta mRNA expression following oral PSK or LEM administration / Morinaga H, Tazawa K, Tagoh H, Muraguchi A, Fujimaki M // Jpn J. Cancer Res.-1994.-Vol. 85, N 12.- P. 1298-1303).

Выявлена иммуномодулирующая активность и у сока плодовых тел данного гриба (Сотникова Н.Ю., Куликова (Милькова) Е.В., Мартенова А.А., Кузнецов О. Ю. Влияние биокомпонентов гриба Lentinus edodes на иммунокомпетентные клетки in vitro у женщин с вагинальным кандидозом. /Тезисы 3-й научной международной конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" 18-20 Мая 1999 г. - с. 137.)
Сок получали путем механического измельчения плодовых тел гриба, из полученной биомассы выжимали сок, который подвергался стерилизации путем ультрафильтрации с использованием каолиновых свечей Шамберлана с размером пор 0,12 мкм (Муравьев И.А. Технология лекарственных форм. М.: Медицина. - 1998 г.).

Технический результат заключается в разработке способа получения биомассы Escherichia coli в препарате колибактерин с большим терапевтическим эффектом за счет увеличения выхода жизнеспособных клеток.

Основные этапы предлагаемого технологического процесса по заявляемому изобретению:
выращивание биомассы Escherichia coli, получение концентрированной биомассы путем центрифугирования, декантация надосадочной жидкости;
в биомассу добавляют защитную среду высушивания и стимулятор - 2% от объема защитной среды, расфасовка в ампулы;
лиофильная сушка расфасованного в ампулы препарата, его маркировка.

Была проведена сравнительная оценка колониеобразующей способности препарата колибактерин при посеве на мясо-пептонный агар и препарата колибактерин с добавлением стерильного сока высшего съедобного гриба Шии-таке.

Биомассу бактерий кишечной палочки из препарата колибактерин высевали на мясо-пептонный агар из различных разведений препарата в растворе 0,9% NaCl из расчета - начальное разведение соответствовало количеству клеток в препарате 10⁹. В опыте в препарат вносили стерильный сок гриба в объеме 2% от объема защитной среды препарата; в качестве контроля использовались разведения препарата без внесения стимулятора. Результаты представлены в таблице (Сравнительная оценка колониеобразующей способности E.coli М-17). При внесении сока в среду в меньшей концентрации (менее 2% от объема защитной среды) стимулирующий эффект был выражен незначительно. При увеличении концентрации более 2% стимулирующий эффект не изменялся, поэтому считаем нецелесообразным увеличивать дозу стимулятора, так как эффект не изменяется, но увеличивается его расход. При внесении сока достоверно (p < 0,005) увеличивается число колониеобразующих единиц с 1,25 ± 0,29 КОЕ/мл - среднее число колониеобразующих единиц в контроле до 7,58 ± 1,16 КОЕ/мл - в опыте, при внесении сока Шии-таке. При увеличении посевной дозы - из разведения 10^-6 - получили также стимулирующий эффект: число колониеобразующих единиц увеличивалось с 44,7 ± 4,16 КОЕ/мл в контроле до 828 ± 79,3 КОЕ/мл в опыте.

Оценивая полученные результаты, считаем, что предлагаемый способ получения активного препарата колибактерин значительно повысит терапевтическое действие препарата за счет повышения регенераторной способности кишечной палочки после лиофилизации.

Изобретение относится к биотехнологии. Получают концентрированную биомассу Escherichia coli, добавляют стимулятор - стерильный натуральный сок высшего съедобного гриба Шии-таке в объеме 2% от объема защитной среды, фасуют в ампулы и лиофильно сушат. Способ позволяет получить препарат, обладающий высоким терапевтическим действием за счет усиления регенераторной способности кишечной палочки после лиофилизации. 1 табл.

Способ получения препарата эубиотика колибактерин, включающий получение биомассы бактерий Escherichia coli, добавление защитной среды, расфасовку в стерильные ампулы, лиофильную сушку, отличающийся тем, что в биомассу на стадии расфасовки в стерильные ампулы добавляют стерильный натуральный сок высшего съедобного гриба Lentinus edodes в объеме 2% от объема защитной среды.