СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СИНДРОМА ГОРЛИНА-ГОЛЬТЦА Российский патент 2001 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано при диагностике множественных базалиом, связанных с синдромом Горлина-Гольтца.

Известен способ иммуногенотипирования (HLA-типирование) у больных с солитарными и множественными базалиомами (Писклакова Т.П., Ильин И.И., Питеркина Л. В. Анализ ассоциаций антигенов системы HLA с базалиомами кожи. / Вестник дерматол., 1991, N 8, с. 10-12).

Было обследовано 86 лиц славянской национальности, не состоящих в родстве, в том числе 42 с солитарными, 44 - с множественными базалиомами (МБ). Контрольную группу составляли 701 донор славянской национальности. Выявляли 8 антигенов локуса A и 15 - локуса B. Установили, что течение опухолевого процесса при множественных базалиомах детерминировано системой HLA, т.е. зависит от набора антигенов HLA, что может служить критерием в дифференциальной диагностике этого заболевания и выборе метода лечения. Было установлено, что у больных множественными базалиомами существует статистически достоверная положительная ассоциация между антигеном B14 и множественными базалиомами.

Недостатком этого способа является то, что он не позволяет выделить в структуре множественных базалиом опухоли, связанные с синдромом Горлина-Гольтца (СГГ).

Наиболее близким является способ диагностики синдрома Горлина-Гольтца путем клинических и иммуногенетических исследований с проведением HLA-типирования антигенов 1-го класса (Молочков В.А., Горохов Н.Г. Синдром Горлина-Гольтца /Вестник дерматол. и венерологии, 1993, N 5 с. 67-70).

Недостатком этого способа является то, что исследуемый материал не давал полную достоверную информацию о наборе антигенов HLA у больного, поскольку в иммунофенотипе не учитывались антигены HLA 2-го класса, которые обеспечивают взаимодействие между всеми субпопуляциями иммунокомпетентных клеток организма с помощью кофактора CD4.

Поставленная задача - устранение указанных недостатков за счет дифференциальной диагностики больных множественными базалиомами с учетом выявленных у них иммунологических особенностей в системе HLA.

Для этого в способе диагностики синдрома Горлина-Гольтца, включающем HLA-типирование антигенов 1-го класса, предложено дополнительно проводить HLA-типирование антигенов 2-го класса и при выявлении антигенов A10, B14 и отсутствии DR1 диагностировать синдром Горлина-Гольтца.

Клиника и течение МБ существенно отличаются от клиники и течения МБ, связанных с СГГ. Поскольку патоморфологическая картина при этих заболеваниях практически совпадает, дифференциальная диагностика между ними должна основываться на комплексной оценке анамнестических, клинических и иммуногенетических данных. Выявление СГГ в структуре МБ позволяет прогнозировать течение опухолевого процесса, выбрать рациональные методы лечения, а также предотвратить рецидивы заболевания.

Способ осуществляется следующим образом.

Взвесь лимфоцитов готовили обычным методом, центрифугировали на градиенте плотности фикола-верографина 1,076 - 1,078, доводя концентрацию лимфоцитов до 1000 - 2000 в 1 мл. В полученной взвеси примесь гранулоцитов не превышала 5-10% моноцитов, жизнеспособность клеток была не ниже 98-100%.

В лунки камеры Терасаки, где под слоем вазелинового масла находились по 0,001 мл различных образцов стандартных тестовых анти-HLA-сывороток, добавляли 0,001 мл приготовленной взвеси исследуемых лимфоцитов. Смесь инкубировали при температуре 220^oC в течение 30 минут при определении HLA 1 класса и при температуре 370^oС - HLA 2 класса. По истечении указанного времени в каждую лунку вносили по 0,005 мл кроличьего комплемента (смесь сывороток 70 - 100 кроликов), после чего микрокамеры инкубировали при температуре 220 - 240^oC в течение 60 минут при определении HLA 1 класса и 120 минут - антигенов 2 класса.

По окончании инкубации к клеткам добавляли 0,0025 мл 5% водного раствора эозина и 0,0025 мл 40% формалина (pH 6,8-7,4) для фиксации клеток. Учет реакции проводили микроскопированием. Интенсивность цитотоксической реакции определялась числом погибших лимфоцитов и оценивалась по специальной 8-балльной шкале. Результаты учитывали в баллах по международной системе.

Результаты учитывали с помощью люминесцентного микроскопа:
Готовили маточный красящий раствор: в 1 мл этанола 96^o растворяли 15 мг акридина оранжевого и 50 мг этидиума бромида, после чего объем раствора доводили до 50 мл дистиллированной водой. Хранили раствор при температуре -200^oС. Перед проведением микролимфоцитотоксического теста из маточного раствора готовили рабочий красящий раствор путем добавления к 1 мл раствора Хенкса 1 мкл маточного красящего раствора.

При проведении микролимфоцитотоксического теста по окончании времени инкубации с комплементом микрокамеру резко встряхивали рукой для удаления вазелинового масла. Затем в каждую лунку микрокамеры вносили по 1 мкл рабочего красящего раствора и выдерживали в течение 5 минут при комнатной температуре. По истечении времени инкубации определяли соотношение "живых" и "мертвых" клеток в каждой лунке, учитывая, что "мертвые" клетки окрашиваются в красный цвет, а "живые" - в зеленый.

Интерпретация результатов:
1 (-) - 10% мертвых клеток - отрицательная реакция;
2 (+) - 11 - 20% мертвых клеток - сомнительно-положительная реакция;
4 (++) - 21 - 40% мертвых клеток - слабо-положительная реакция;
6 (+++) - 41 - 80% мертвых клеток - положительная реакция;
8 (++++) - 81 - 100% мертвых клеток - выраженно-положительная реакция.

Был обследован 21 пациент с подозрением на синдром Горлина-Гольца. Все больные относились к смешанной Российской популяции и не состояли в родстве между собой. Контрольную группу составили 312 доноров смешанной Российской популяции при определении антигенов системы HLA 1 класса и 75 доноров при определении антигенов системы HLA 2 класса.

Определение антигенов системы HLA 1 и 2 класса авторы проводили в общепринятом двухступенчатом микролимфоцитотоксическом тесте, основанном на способности HLA-сывороток цитотоксически действовать на лимфоциты, имеющие соответствующие антигены в присутствии комплемента (NIH - National Institute Helth, 1972).

Верифицировали антигены системы HLA: локус A - 8 антигенов, B - 17 антигенов, локус DR - 9 антигенов.

Было установлено, что течение опухолевого процесса при синдроме Горлина-Гольтца и множественных базалиомах кожи детерминировано системой HLA. СГГ достоверно ассоциируется с HLA A10 и B14 при отсутствии DR1.

Пример 1.

Больная Г. , 45 лет. Обратилась к дерматоонкологу в августе 1996 года. Больна 10 лет. На коже лица и туловища имелись 12 безболезненных опухолевых образований размером от 0,4 до 2,5 см в диаметре, с четкими границами, шелушением в центре и валиком из отдельных мелких блестящих роговых узелков по периферии. Регионарные лимфатические узлы не были увеличены. Гистологический диагноз: солидно-аденоидные базалиомы. Пациентка наблюдается стоматологом по поводу кист в костях верхней и нижней челюстей, окулистом по поводу слепоты, обусловленной атрофией зрительного нерва и глаукомы. В соответствии с предлагаемым способом больной произведено HLA-типирование, обнаружены антигены A1, 10, B14, B40, DR2, DR4. Согласно заявляемому способу, выявление антигенов HLA A10, B14 и отсутствие антигена DR1 соответствует синдрому Горлина-Гольтца. На основании клиники и течения заболевания больной был поставлен диагноз: синдром Горлина-Гольтца.

В связи с выявленной патологией было откорректировано лечение.

Пример 2.

Больной Д., 61 год. Обратился к дерматоонкологу в марте 1997 года. Болен 2 года. На коже лица и туловища имелись 5 безболезненных опухолевых образований размером от 0,5 до 1,2 см в диаметре, с четкими границами, шелушением в центре и валиком из отдельных мелких блестящих роговых узелков по периферии. Регионарные лимфатические узлы не были увеличены. Гистологический диагноз: солидные базалиомы. В соответствии с предлагаемым способом больному произведено HLA-типирование, обнаружены антигены A9, B14, B17, DR5, DR6. Согласно заявляемому способу, выявление антигена HLA B14 и отсутствие антигенов A10 и DR1 не соответствует диагнозу синдрома Горлина-Гольтца. На основании клиники и течения заболевания больному был поставлен диагноз: множественные базилиомы кожи.

Приведенные клинические наблюдения подтверждают, что у больных с синдромом Горлина-Гольтца имелись характерные иммуногенетические признаки: присутствие антигенов HLA A10, B14 и отсутствие антигена HLA DR1.

Предлагаемый способ может быть использован для ранней и дифференциальной диагностики синдрома Горлина-Гольтца, прогнозирования течения заболевания, что обеспечивает подбор рациональных методов лечения, предотвращающих рецидивы.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при диагностике множественных базалиом, связанных с синдромом Горлина-Гольтца. Способ включает HLA-типирование антигенов 1-го и 2-го классов, и при выявлении антигенов А10, В14 и отсутствии DR1 диагностируют синдром Горлина-Гольтца. Технический результат: способ обеспечивает раннюю дифференциальную диагностику заболевания, прогнозирование течения и подбор рациональных методов лечения, предотвращающих рецидивы.

Способ диагностики синдрома Горлина-Гольтца, включающий клинические и иммуногенетические исследования с проведением HLA-типирования антигенов 1-го класса, отличающийся тем, что дополнительно проводят HLA-типирование антигенов 2-го класса и при выявлении антигенов А10, В14 и отсутствии DR1 диагностируют синдром Горлина-Гольтца.