Способ получения плазмидной ДНК в составе полимерных наносфер для доставки Российский патент 2024 года по МПК A61K38/00 A61K9/51 A61K47/30 B82Y5/00 

Изобретение относится к области медицины, в частности к наномедицине, которая использует нанотехнологии и наноструктурные системы в области нанодиагностики и нанотерапии.

Генная терапия привлекает значительное внимание для лечения многих хронических болезней и генетических нарушений и также используется как альтернатива химиотерапии при лечении некоторых онкологических заболеваний.

Однако ДНК подвергается деградации при действии нуклеаз в кровотоке при внутривенном введении и «голый» ген не может поступать в клетки сам по себе. Поэтому необходимо содействие соответствующего вектора.

Векторы как носители гена должны быть созданы для компактизации и защиты генетического материала от преждевременной деградации в кровотоке и эффективного переноса терапевтического гена к ткани-мишени и клеткам-мишеням.

Исходно многие исследования были в основном сконцентрированы на вирусных геекторах, включающих аденовирусы, лентивирусы (в том числе вирус СПИДа) и ретровирусы. Хотя эти вирусные носители проявляют высокую эффективность в доставке гена и экспрессии, основные недостатки, связанные с этими носителями, включают тяжелые иммунные и воспалительные реакции, рекомбинацию широкой разновидностью вирусов, ограничения в размере инсерционного сегмента [1]. Сложность получения качественной фармацевтической продукции ограничивает их использование в лечении заболеваний и поддерживает конструирование невирусных векторов для доставки гена.

В настоящее время невирусные векторы предложены как альтернатива для более безопасной генной терапии [2-14].

Невирусные векторы, включающие катионные полимеры, липиды, дендримеры и пептиды представляют ряд преимуществ по сравнению с их вирусными двойниками, такие как низкая иммуногенность, отсутствие эндогенных вирусных рекомбинаций, гибкое конструирование и их легкое изготовление.

Однако невирусные генные носители постоянно проявляют значительно редуцированную эффективность трансфекции по сравнению с вирусными векторами, которые эволюционно обладают способностью обходить клеточные барьеры и механизмы иммунной защиты. Тем не менее эти соединения приобретают значительное внимание для генной терапии за счет их высокой биосовместимости.

В последнее десятилетие большинство исследований сосредоточено на создании невирусных векторов, которые могут образовать комплексы с ДНК со способностью обходить барьеры как in vitro, так in vivo для доставки гена.

Основной целью генной терапии является способ получения белкового терапевтического продукта и его доставка к ткани-мишени. Например, для его доставки в центральную нервную систему (ЦНС), для лечения пациентов с нейродегенеративными заболеваниями, однако, такие заболевания связанные с единичными генетическими мутациями довольно редки и использование генной терапии с целью изменения генных дефектов в неврологии ограничены.

При этом, такой способ лечения аналогичен фармакологическим подходам, которые используют белковые лекарственные средства для лечения пациентов с различными заболеваниями.

Однако, в этом случае существуют проблемы, связанные с использованием белков для лечения различных заболеваний и, в том числе, неврологических. Это определяется тем, что молекулы белков характеризуются высокой молекулярной массой и, по своей сущности, высоколабильны. Более того, доставка белковых лекарственных средств в ЦНС связана с неспособностью большинства белков преодолевать гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Кроме того, при прямой инъекции белка в паренхиму мозга не наблюдается значительный диффузии белка от места инфузии в ткань, которая является их мишенью, что значительно уменьшает доступность и терапевтическое действие белков, а также может приводить к значительным побочным эффектам.

По понятным причинам, для генной терапии не свойственны проблемы, связанные с доставкой терапевтических белков. Задача генной терапии заключается в доставке гена, который кодирует терапевтический белок. После того, как клетки-мишени трансдуцированы генетическим материалом, клетки начинают производить терапевтический белок на фармацевтическом уровне и в том месте где он необходим. Поэтому невирусные системы, особенно синтетические ДНК, становятся наиболее подходящими для их конструирования и испытания в лабораторных и в клинических условиях [5, 6].

В настоящее время интенсивно развиваются невирусные способы переноса гена. Два способа переноса гена довольно часто используют в клинических испытаниях. Один из них представляет собой прямую инъекцию плазмидной ДНК (pDNA), содержащую трансген, в ткань-мишень. Этот способ используют в 14% случаев в клинических испытаниях, чаще всего введение ДНК и/или pDNA проводят внутримышечно при многократных инъекциях.

Второй способ используют для введения в качестве вектора катионные липиды, так называемые липосомы, которые содержат ДНК, и этот способ называют липофекцией. Этот способ используют в 9% клинических испытаний. Катионные липиды способствует ДНК и/или pDNA входить в клетки-мишени. Как правило, невирусный перенос генов не приводит к интеграции трансгена в ген хозяина, то есть трансген находится в ядре клеток как внехромосомная ДНК (эписомная ДНК - это молекулы ДНК, которые сохраняются в ядре без интеграции в хромосомную ДНК).

Критическим условием для успешного использования ДНК в качестве фармацевтического средства или для научно-исследовательских технологий является эффективная трансфекция ДНК (в обычной практике только незначительная часть клеток захватывает и экспрессирует экзогенную ДНК).

Рассматривают три основных барьера, которые препятствуют доставке ДНК: низкое поглощение клетками и прохождение через плазматическую мембрану, неадекватное высвобождение молекул ДНК, отсутствие ядерного таргетинга (targeting, направление на мишень). Кроме этих барьеров для эффективной клеточной доставки ДНК, необходимо отметить ряд других препятствий, включающих оптимальную конденсацию ДНК, размер ДНК комплексов, маршрут введения, биораспределение, биодоступность, клеточный и тканевой таргетинг и цитотоксичность.

Поэтому основными требованиями для доставки ДНК являются развитие систем, которые являются как высокоэффективными в доставке и экспрессии, так и пригодными для научных исследований, так же как в клинических условиях [11].

Системы для доставки ДНК должны обладать следующими свойствами: легко образовывать комплексы, для этого могут быть использованы модулирующие компоненты, способные проводить упаковку ДНК in vitro, обеспечивая эффективную доставку ДНК, приводящую к тотальной трансфекции (то есть ДНК должна быть доставлена к большему количеству определенных клеток), стабилизировать ДНК как до, так и после поглощения (например, с использованием нетоксичных биосовместимых материалов), обладать способностью обходить или «ускользать» из эндосом, подвергаться декомплексации (например, при внутриклеточном контролируемом высвобождении), и обладать эффективным ядерным таргетингом с высоко устойчивой и регулируемой экспрессией белков на терапевтическом уровне.

Обычно ДНК комплексы поглощаются клетками, посредством эндоцитоза, при этом способ поглощения определяет последующее высвобождение ДНК, направление миграции и продолжительность жизни в клетке. Эндоцитоз представляет многоступенчатый процесс, включающий связывание, интернализациию, формирование эндосом, слияние с лизосомами и лизис. Экстремально низкие значения рН и протеолитические ферменты внутри лизосом, обычно, приводят к деградации поглощенной ДНК и ассоциированных комплексов.

Наконец ДНК, которая сохраняется как в результате процессирования при эндоцитозе, так и при воздействии цитоплазматических нуклеаз, затем должна диссоциировать из конденсированных комплексов перед или после вхождения в ядро.

Считают, что вхождение в ядро осуществляется либо через ядерные поры, диаметром 10 нанометров либо в процессе деления клетки. Внутри ядра эффективность трансфекции доставленной ДНК в основном зависит от композиции экспрессионной системы гена.

Достижение клеточного ядра - это последнее препятствие на пути доставки ДНК.

Необходимо существенное клеточное предохранение ДНК от внеклеточной и внутриклеточной деградации в продолжении длительного периода времени на пути к клеточному ядру. Внеклеточная ДНК может быть защищена при образовании комплексов с различными полимерами и липидами.

В случае системной доставки ДНК подвержена клиренсу из русла крови. Этот процесс известный как опсонизация удаляет 80-90% гидрофобных частиц из русла крови, и это является основным ограничивающим фактором для доставки ДНК при использовании искусственных комплексов липидов и полимеров, так называемых липоплексов и полиплексов [15].

Внутриклеточная ДНК должна «ускользать» из эндосомальных путей, где она может подвергаться деградации. При сравнении трех различных типов катионньгх липидных соединений показано, что эффективность доставки ДНК коррелирует не только с поглощением, но также с дестабилизацией и с «ускользанием» из эндосом [7].

Известны способы для повышения раннего высвобождения ДНК из эндосомальных путей. Препарат Chloroquine поднимает рН в эндосомах, ингибируя лизис, и его используют для снижения деградации ДНК [7]. Chloroquine - слабоосновной препарат, который повышает трансфекционную активность полиэлектролитных комплексов в отношении многих клеточных линий. Высокие концентрации Chloroquine могут способствовать распаду (деассамблеи) полиэлектролитных комплексов ДНК. Chloroquine является слабоосновным, незаряженным при нейтральном значении рН, но несет заряд при рН 5,5. Chloroquine обладает способностью проходить через мембраны в своей незаряженной форме, но когда становится протонированным и аккумулируется в кислой среде вакуолей в положительно заряженной, мембранно-непроницаемой форме. И в этом случае, можно допустить, что Chloroquine препятствует подкислению эндосом и повышает возможность переноса ДНК в цитоплазму.

Механизмы, участвующие в эндосомальном высвобождении ДНК катионными векторами на основе полиплексов, окончательно не установлены. Рассматривают две гипотезы, объясняющие «ускользания» полимерного вектора из эндосом. Одна гипотеза основана на идее, что физическое разрушение отрицательно заряженной эндосомальной мембраны происходит при прямом взаимодействии с катионным полимером, например, поли-L-лизином (PLL, poly-L-lysine). Такой механизм, по-видимому, зависит и от композиционного состава мембраны клетки (то есть от типа клетки).

Второе объяснение в отношении разрушения эндосом катионными полимерами с ионизированными аминогруппами основано на гипотезе, которую называют эффектом «протонной губки» (proton sponge effect) (гипотеза протонной губки основана на представлении механизма доставки chloroquine). Эндосомальные мембраны содержат фермент с АТФазной активностью, который активно опосредует транспорт протонов из цитозоля в везикулы, приводя к подкислению компартмента [7]. Гипотеза, основанная на эффекте «протонной губки», допускает, что полимеры такие как PEI и РАМАМ (poliamidoamine), содержащие большое количество вторичных и третичных аминов, могут поддерживать рН, вызванное АТФазой в эндосомах, дополнительно транспортируя протоны для достижения требуемого рН. Аккумуляция протонов в везикуле приводит к притоку противоположно заряженных ионов (ионы Cl^-), что вызывает осмотическое набухание и разрушение эндосомальной мембраны, что в свою очередь, приводит к высвобождению полиплекса (полимерного вектора) в цитоплазму [9].

Однако, вопреки этим гипотезам большинство систем, доставляющих гены, могут быть-«остановлены» именно на стадии высвобождения ДНК в цитоплазму.

После того как полиплексы поступают в цитоплазму они должны преодолеть дополнительные барьеры в цитозоле. Промежуточные филаменты и микрофиламенты организованы в плотную сеть, формируя сетчатую структуру цитоскелета, который строго препятствует диффузии больших молекул pDNA (плазмидная ДНК).

После высвобождения («ускользания») из эндосом нуклеиновая кислота должна проходить через цитоплазму и поступать в ядро. Мобильность молекул больших размеров, таких как pDNA довольно низкая в цитоплазме, что делает pDNA доступной для цитоплазматических нуклеаз. Таким образом pDNA должна быть защищена, и быть доступной для вхождения в ядро. Важным фактором в транспорте ДНК через цитоплазму является степень ее мобильности, которая зависит от размера и сферической структуры молекулы (кольцевая ДНК>плазмидная ДНК>линейная ДНК) [16]. На самом деле молекулы ДНК могут быть свободными или оставаться в ассоциации со своим носителем и находиться в компактном состоянии. Компактное состояние ДНК может повышать мобильность в цитозоле и может создавать повышенную стабильность в отношении цитоплазматических нуклеаз.

Диссоциация ДНК из вектора необходима для эффективной экспрессии гена [17]. Стабильная и длительная экспрессия обычно достигается при помощи трансгенной инсерции (включение инсерционного сегмента (ДНК-вставка)) в геном хозяина, тогда как неустойчивая и кратковременная экспрессия является результатом сохранения эписомного трансгена - внехромосомной ДНК (эписомы).

Показано, что микроинъекции комплексов полиэтиленимина (PEI, polyethyleneimine) с ДНК приводит к 10-кратному повышению уровня экспрессии трансгена по сравнению с «голой» ДНК (naked DNA) и повышение экспрессии может быть следствием повышения цитоплазматической мобильности за счет уменьшения размера компактной ДНК. Эти результаты показывают, что вхождение в ядро является еще одним важным барьером (и последним препятствием) для эффективной трансфекции (поскольку для ДНК необходим доступ к ДНК-транскрипционному комплексу, который присутствует в ядре).

Двойная мембрана ядерной оболочки прерывается крупными белковыми структурами, которые названы ядерными поровыми комплексами (NPCs, nuclear pore complexes) [18]. Эти белковые комплексы позволяют прохождению молекул размером 9 нм (40-60 кДА) через поры, но в случае макромолекул большой молекулярной массы для их прохождения необходимы «челночные» молекулы, обеспечивающие транспорт, который является энергозависимым. Ядерный поровый комплекс (NPC) опосредует транспорт ионов, молекул небольшой молекулярной массы, белков, РНК, рибонуклеопротеинов как в ядро, так и из ядра.

Имеются специфические последовательности в структуре белков, необходимые для вхождения в ядро, которые названы последовательностями ядерной локализации (NLS, nuclear localization sequence), которые опосредуют движение внутриклеточного белка к ядерным порам [19-27]. Эти NLSs узнаются в цитоплазме растворимым белком импортином-α. Комплекс NLS-импортин-α связывается с другим белком, импортином-β и этот трехкомпонентный комплекс погружается в NPC и может поступать в ядро.

NLSs не являются строго установленными последовательностями, но между большинством из них имеется сходство. Обычно NLSs содержат кластеры из четырех или более катионных аминокислотных остатков (АК), которые фланкированы α-спиральными «преградами» (α-helix-breakers) из пролинов и глицинов. Одна группа NLS, хорошо известная как минимальная последовательность (-PKKKRPV¹³⁹), необходима для ядерной локализации супер-Т-антигена (антигенный надмолекулярный комплекс вируса SV40). При единичной замене в катионном кластере К¹²⁸ на N или Т ядерный таргетинг отменяется.

В экспериментах по инъецированию ДНК в присутствии даже коротких NLS пептидов, взаимодействующих с ДНК в результате абсорбции, показано значительное влияние на ядерное поглощение.

Эти данные позволяют предполагать, что если pDNA и NLS пептиды могут достигать ядерных пор одновременно, в этом случае нековалентное взаимодействие с NLS пептидом может иметь значительный эффект.

В последующих экспериментах проводили ковалентное связывание NLS пептида с pDNA. Было установлено, что импорт ДНК имел место только в том случае, когда использовали ковалентный комплекс ДНК - минимальная NLS последовательность вместо ДНК - NLS пептид. Таким образом, эффективный импорт pDNA имел место только при использовании полной минимальной последовательности NLS, которая включала регуляторные элементы [18].

Показано, что в культуре клеток перенос генов для полиплекса и липоплекса происходит более эффективно за счет митотической активности. Это обусловлено с тем, что в процессе митоза вследствие утраты ядерной мембраны происходит смешивание нуклеоплазмы и цитоплазмы. Это может означать, что неделящиеся клетки редко трансфецируются и это может быть определяющим моментом для доставки генов к опухолевым клеткам, особенно в паренхиме мозга, где здоровые клетки имеют очень низкую или не имеют никакой способности к делению.

Перспективы развития невирусный генной терапии зависят от рассмотрения различных барьеров для доставки полинуклеотидов. Они включают физико-механические барьеры, которые ограничивают конструирование определенных доставляющих устройств, физико-химические барьеры, которые оказывают влияние на самосборку коллоидных формуляторов, биологические барьеры, которые препятствуют доставке ДНК к ее сайт-мишени.

Развитие экспериментальных систем для доставки генетического материала определяется необходимостью получения фармакологических продуктов, что является еще одной причиной для выяснения основных процессов транспорта, которые определяют биораспределение полученных фармакологических продуктов (как во внеклеточной, так и внутриклеточной среде).

Имеется много факторов, которые оказывают влияние на степень и продолжительность экспрессии гена после введения генного препарата, предназначенного для получения лекарственного продукта, фенотипическая экспрессия гена с образованием мРНК и конечного продукта транскрипции, синтеза полипептидной цепи белковой молекулы на матрице мРНК.

Доставка генного препарата является существенной стороной, однако, конструирование и оптимизация экспрессионной системы также является определяющей частью в формировании полученного генного продукта в качестве лекарственного средства.

Доставка гена представляет особые требования для специалистов, которые заняты в области доставки лекарственных средств. Несомненно, что пассивный транспорт лекарственных средств (обычно плазмидной ДНК) к ее сайт-мишени (целенаправленно к ядру клетки) чрезвычайно неэффективен. Поэтому для доставки гена необходимы совсем другие требования и условия, чем для доставки лекарств низкого молекулярного веса. Доставка гена может быть представлена как серия препятствий (как внеклеточных, так и внутриклеточных), которые последовательно истощают массу ДНК на пути к сайт-мишени.

Основным решающим фактором для генной терапии для каждого клинического симптома является количество белка, который требуется экспрессировать, чтобы получить желаемую терапевтическую активность.

На практике значение любого биологического барьера будет зависеть как от определенного маршрута введения генетического препарата, так и от локализации клеток мишеней. Поэтому биораспределение и значение барьеров для биораспределения следует рассматривать в контексте каждого клинического симптома.

Ключевой вопрос заключается в том, будет ли проводиться введение внутривенно или с помощью другого парентерального маршрута. Прямое введение генетического препарата в ткань-мишень представляет достаточно простую задачу по сравнению с направленной доставкой из системной циркуляции к определенной ткани-мишени.

Имеются данные в отношении локализации и степени экспрессии гена после внутривенного введения ДНК комплексов. Однако использование ДНК комплексов затрудняет возможность сделать заключение об их биораспределении, поскольку такие комплексы могут приводить к продолжительной циркуляции ДНК доставляющих систем.

Таким образом, перспективы для широкого использования введения препарата из системной циркуляции имеет определенные ограничения на данный момент. Однако, введение препарата с помощью других маршрутов для прямой доставки к ткани-мишени может быть вполне вероятным, в частности, при условии, что продолжительность жизни терапевтического лекарственного препарата составляет несколько дней или недель.

Различают пассивную и активную доставку (пассивный и активный таргетинг) белков и нуклеиновых кислот в ядро клеток [28, 29]. Поскольку ядро клеток содержит большое количество катионных белков (в основном гистонов) и соответственно анионные нуклеиновые кислоты, представляется очевидным, что когда полиэлектролиты пассивно переносят в ядро они обладают тенденцией удерживаться в ядре. Это можно рассматривать как форму пассивной направленной доставки и может быть использовано для содействия повышения активности в ядре или как механизм, который содействует направленному контролируемому высвобождению. Протеины или полимеры, содержащие поликатионные или полианионные домены обладают способностью удерживаться в ядре, но особое внимание обращено к поликатионным доменам вследствие их способности содействовать мембранной транслокации. Механизмы их транслокации пока полностью не установлены, но их удержание в ядре может быть простым неспецифическим связыванием с ДНК.

Олигонуклеотиды аккумулируются в ядре при их поступлении в результате пассивной диффузии через NPC (поровый белковый комплекс). Основное препятствие для достижения олигонуклеотидами ядра представляет мембранное ограничение, которое препятствует доступу в цитоплазму. Это привело к нескольким стратегиям химического модулирования олигонуклеотидов для стимулирования диффузии через мембрану [23]. Хотя пассивный таргетинг олигонуклеотидов, модифицированных короткими пептидами или гибридными молекулами, приготовленных при химическом соединении, представляется возможным, однако пассивный таргетинг не используют для доставки лекарственных средств в ядро, поскольку таргетинг может быть улучшен, но доставка в цитоплазму клетки остается под вопросом.

Активный таргетинг макромолекул таких как ДНК в ядро является предметом исследований в генной терапии. При использовании невирусной генной терапии терапевтическая единица представлена как expression cassette (полигенный экспрессирующий кластер) часто в форме плазмиды (pDNA) с молекулярным весом 2-3 миллиона Да. Такие молекулы имеют очень низкую мембранную транслокацию и для их доставки требуется создание доставляющих систем для преодоления ряда биологических барьеров на пути их поступления в ядро.

В ранних исследованиях концепция использования совместного введения NLSs пептидов с ДНК имела положительный эффект на ядерное поглощение в ооцитах zebrafish. Позднее был проведен ряд исследований по доставке pDNA в клетки млекопитающих. Когда катионные NLS пептиды вводили совместно с ДНК в виде смеси, то есть в виде полиэлектролитного комплекса наблюдали умеренное повышение трансфекции. Однако в этих условиях нет гарантий того, что ДНК сохраняет связь с NLS в эндосомах или цитоплазме, или даже после связывания NLS с импортином.

Можно предположить, что стратегия физического связывания катионных остатков NLSs с ДНК определяется неспецифическим связыванием и маловероятно, что NLS способны связывать импортен или нуклеопорин.

Исходя из этих наблюдений были разработаны стратегии для создания систем ядерного таргетинга в более «жесткой» форме, то есть посредством химического соединения молекул с помощью связывающего агента (линкера). В 1998 году были проведены первые серии экспериментов по химическому соединению NLSs пептидов с ДНК.

Множественные копии NLS минимального SV40 T-ag (мотив PKKKRKV SV40 предетавляют как исходный прототип NLS) были химически соединены с ДНК посредством формирования N3 аденин комплексов (N3 adenine adducts) [30].

Исследовали ядерное поглощение ДНК-конструкции, которые модифицировали от 24 до 101 NLSs пептидами на 1kb ДНК. Показано, что по крайней мере 40 NLS пептидов на 1kb ДНК необходимо для повышения ядерного поглощения. Максимальный уровень повышения экспрессии гена был, приблизительно, 4-х кратный, когда линейный фрагмент ДНК, модифицированный NLS, был химически соединен с линейной expression cassette. Отсутствие эффективности предполагает, что связывание конструкции NLS-ДНК с импортинами может быть ограничено за счет стерического препятствия. Эксперименты, которые включали химическое соединение коротких NLS пептидов с ДНК были мало обнадеживающими. Так были приготовлены аналоги линейных конструкций, которые использовали при внутрицитоплазматической и внутриядерной микроинъекции при исследовании активности. Химическое соединение NLS не повышало экспрессии гена в этих системах [31].

Обобщая приведенные данные, можно прийти к заключению, что химическое соединение минимального SV40 T-ag непосредственно к ДНК для формирования системы успешной доставки в ядро маловероятно. Определенная степень успеха достигается при химическом соединении NLSs с комплексирующими полимерами или трансфецирующим агентам (например, PEI) или с крупными фрагментами, протяженных катионных пептидов, например, такого белка как протамин. При этом было установлено ограничение трансфекции до 2-х кратного уровня от 5-и кратного значения.

Наряду с этими данными большое внимание уделяли анализу способности презентирования (представления) комплексов ДНК-NLSs как импортинам (Importin), так и нуклеопоринам.

В дальнейших исследованиях эффективность связывания определяли, используя разработанный импортин-связывающий анализ [32]. Когда NLS пептиды напрямую связывают с ДНК можно допустить, что анионные фосфатные группы вероятно секвестируют (изолируют) катионные NLS пептиды, которые при этом становятся недоступными для связывания.

Альтернативой химическому соединению коротких пептидов, содержащих NLSs и ДНК представляет химическое соединение белков, содержащих NLSs или полипептидов этих белков к ДНК, используя ковалентное связывание или связывание посредством технологии взаимодействия стрептовидин-биотин.

В случае активного таргетинга примущество состоит в использовании NLSs в составе нативных белков или фрагментов белков значительного размера, содержащих NLSs. При этом NLSs с большей вероятностью будут презентированы (представлены) в составе третичной структуры белка для последующего прочного связывания с релевантными ядерными транспортными белками. Кроме того, катионный NLS может быть защищен от нежелательных специфических взаимодействий с фосфатными группами в ДНК.

В ранних исследованиях было установлено, что реверсивное связывание белков хозяина, таких как гистоны и транскрипционные факторы, могут опосредовать доставку ДНК в ядро [33].

Представленные данные гарантируют, что ДНК-связывающие домены могут обеспечивать доступность и возможность для связывания белков клеток хозяина. В первую очередь, ДНК должна быть доставлена в перинуклеарное (околоядерное) пространство клетки-мишени, где происходит конденсация ДНК в форме частиц, и также защита от деградации, так и для стимулирования направленной внутриклеточной миграции [34].

Таким образом использование белков клеток хозяина для стимулирования ядерного импорта сохраняется как парадигма.

Природные конденсирующие агенты ядра клеток - гистоны используют для конструкции комплексов, которые высоко организованы и поэтому более стабильные. Имеются данные, что комплексы Н2А/Н2 В-ДНК способны трансфецировать клетки более эффективно, чем липофектамин [21].

Более существенное соединение макромолекул можно достигнуть, используя технологию стрептовидин-биотин или прямое ковалентное соединение NLS белка.

В исследовании [28] изучали ядерную локализацию, используя линейные ДНК молекулы покрытые синтетическим NLS-стрептовидином, содержащим 8 NLS пептидов на тетрамер спрептовидина. NLS-стрептовидин был соединен с молекулами ДНК, причем каждая молекула на одном конце содержала единственный биотилированный нуклеотид. Эти конструкции микроинъецировали в клетки или вводили в дигитонин-пермиабилизированные клетки для исследования ядерного поглощения ДНК. Авторы пришли к заключению, что ДНК может быть доставлена посредством NLS-опосредованным транспортом, но эффективность транспорта была ограничена размером ДНК, который составлял приблизительно 1 kb.

Поскольку генетические изменения являются причиной ряда тяжелых патологий, считают, что следующее поколение лекарственных средств должно основываться на использовании заряженных биологических макромолекул, таких как плазмидной ДНК (pDNA) и катионных белков.

При проведении генной терапии чужеродная ДНК должна быть введена в клетки-мишени посредством использования генетических векторов для усиления их клеточного поглощения и внутриклеточного процессирования экзогенных нуклеиновых кислот.

В настоящее время поддерживаются исследования, направленные на альтернативные системы векторов, в частности, полиплексы.

Нуклеиновые кислоты (полинуклеотиды) представляют собой гидрофильные макромолекулы большого размера, несущие отрицательные заряды. Молекулы ДНК высоколабильны в биологических средах организма и не способны эффективно пересекать биологические мембраны. Как молекулы ДНК, так и поверхность клеток заряжены отрицательно, поэтому поступление экзогенных генов внутрь клеток не происходит спонтанно, то есть не является эффективным процессом.

Невирусные векторы, которые включают катионные белки (или пептиды), являются предпочтительными, поскольку они неиммуногенны и легко подвергаются синтезу, образуют стабильные комплексы с плазмидной ДНК (pDNA), не ограничены размерами доставляемой ДНК, обеспечивают защиту pDNA от действия ДНКаз и могут быть получены в промышленном масштабе.

Специфические особенности, которые присущи невирусным векторам, включают их размеры, которые лежат в пределах нанометров, что определяет их оптимальную клеточную интернализацию и их устойчивость к агрегации в крови, сыворотке и внеклеточных жидкостях. Кроме того, они должны проявлять эффективность как при их свободной интернализации клетками-мишенями или при деассамблее комплексов и высвобождении «полезного груза» в ядро клетки после интернализации.

Молекулярная ассоциация катионных белков с нуклеиновыми кислотами имеет решающее значение для таких биологических процессов как регуляция гена, транскрипция, трансляция, ДНК репарация, репликация и рекомбинация.

Это основано на данных исследований, проведенных в 1970-1980 гг. когда были получены кристаллические структуры комплексов белок-ДНК, на многочисленных структурах было показано как белки связаны с ДНК.

На основании данных кристаллографии структур белок - нуклеиновая кислота стало очевидно, что электростатические взаимодействия между положительно заряженными боковыми цепями белка и отрицательно заряженными остатками фосфорной кислоты (фосфатами) сахарофосфатного остова ДНК играют основную роль в молекулярной ассоциации белков с нуклеиновыми кислотами.

В настоящее время гистоны рассматривают как эффективные носители для доставки генов в клетки благодаря их уникальным свойствам, а именно их способности связывать и конденсировать ДНК, прямой транслокации через клеточную мембрану в цитоплазму и направленной доставки в ядро клеток.

Известно, что гистон H1 и коровые гистоны (гистоны кора нуклеосомы - Н2А, Н2В, Н3 и Н4) напрямую пересекают клеточную мембрану посредством пассивной диффузии [22]. Более того в структуре коровых гистонов содержатся короткие последовательности, известные как сигналы ядерной локализации (NLS), которые позволяют гистонам аккумулироваться в ядрах. Белки-переносчики, несущие сигналы ядерной локализации, содержащие кластеры основных аминокислот, связываются с классом белков известных как кариоферины (импортины), которые входят в состав ядерной белковой структуры, содержащей поры - ядерный поровый комплекс (nuclear pore complex, NPC). После связывания со своим кариоферином белок-переносчик направленно доставляется в NPC, который представляет большой макромолекулярный комплекс (125 МДа), который перфорирует ядерную оболочку, что позволяет макромолекулам поступать из цитоплазмы в ядро и наоборот.

Хотя все гистоны связывают ДНК, однако, их трансфекционная эффективность различается. Гистон Н2А обладает большей трансфекционной эффективностью, чем H1, Н2В и Н4. Поэтому помимо электростатического взаимодействия специфические структуры и определенные домены в различных классах гистонов также необходимы для формирования нанокомплекса с нуклеиновой кислотой. В случае гистона H1 ключевым элементом в компактизации нуклеиновой кислоты является С-терминальный домен, который определяет связывающую способность. В случае гистона Н2А основной кластер для контакта с ДНК локализован в N-терминальном домене. Это взаимодействие аналогично клипу (clip, зажим). Структура этого клипа представлена двумя короткими альфа-спиралями. В нуклеосомной коровой частице N-терминальный домен гистона Н2А, состоящий из 37 аминокислотных остатков, идентифицируется как поверхность для взаимодействия с ДНК, где имеется пять контактных участков по остаткам основных аминокислот (позиции 15, 17, 20, 29 и 32) в этом домене.

Поскольку культивирование клеток требует физиологические условия, представляется очевидным, что нанокомплексы могут агрегировать в процессе трансфекции. Эффективность трансфекции имеет отношение к агрегации комплекса гистон - ДНК, и агрегация оказывает влияние на эффективность трансфекции и, как показано для гистона H1 - ДНК комплекса, лежит в широком весовом отношении.

В специальных экспериментах была проведена оценка эффективности трансфекции нанокомплексов H1 - ДНК различных размеров [19]. Была установлена прямая связь между размером и эффективностью трансфекции комплексов H1 - ДНК при различных ионных силах, при которых проводили трансфекцию путем добавления смеси прямо в систему без разбавления культуральной средой. При этом трансфекцию не наблюдали, когда небольшие комплексы добавляли прямо к клеткам, в то время как высокая доставляющая способность была достигнута после деагрегации комплексов в культуральной среде. Наблюдаемый феномен показал, что эффективность трансфекции не зависит от размера и структуры исходно сформированного нанокомплекса H1 - ДНК, а скорее связана с имеющей место деагрегацией нанокомплекса H1 - ДНК в культуральной среде.

Во многих случаях использование гистонов для доставки ДНК в клетки более эффективно, чем для ряда известных невирусных систем (Pat. US 2004/0102606 A1) [35]. Показано, что гистон Н2А, содержащий в составе NLSs, обеспечивает его направленную доставку из цитоплазмы в ядро. Кроме того, описано использование различных фрагментов гистона Н2А для трансфекции клеток in vitro.

В патенте WO 99/19502 [36] описано использование гистонов Н3 и Н4 для трансфекции клеток in vitro. В патенте WO 00/15825 [37] описано использование суммарного гистона для трансфекции in vitro. В патенте US 6180784 В1 [38] описано использование гистона H1, а также коровых гистонов (Н2А, Н2В, Н3 и Н4) для трансфекции клеток in vitro.

Известно, что гистон Н1 не содержит в своем составе сайта сигнала ядерной локализации (NLS), однако обладает способностью к прямой клеточной трансфекции. Предполагают, что транспорт гистона H1 из цитоплазмы в ядро ответственна последовательность, содержащая положительно заряженные аминокислоты в его С-терминальном домене.

В настоящее время используют рекомбинантные гистоны, содержащие определенные модификации, которые улучшают их векторные свойства. Использование рекомбинантных гистонов позволяет стандартизировать процесс их получения в отличие от гистонов, которые получают из животных тканей.

В патенте RU 2637371 [39] описан способ доставки плазмидной ДНК в эукариотические клетки с помощью рекомбинантного гистона Н2А и химерного белка Н2А-ТАТ. Установлено, что после совместной инкубации ДНК с рекомбинантным гистоном Н2А и химерным белком Н2А-ТАТ или химерным белком Н2А-ТАТ в присутствии холинового эфира жирной кислоты и при проведении трансфекции в клетки попадает ДНК и наблюдается синтез белков, гены которых входят в состав доставляемой ДНК.

Развитие генетической инженерии обеспечивает новые подходы для включения функциональных молекулярных совокупностей в состав молекул белков. На основании такого подхода можно создавать мультифункциональные молекулы гистонов, при получении химерных молекулярных структур при слиянии молекул гистонов с пептидами или белками для устранения барьеров, возникающих при проведении трансфекции нуклеиновой кислоты в клетки. Кроме того, нанокомплексы гистон - ДНК покрывают различными полимерными материалами, которые защищают их от ферментативной деградации, для их контролируемого высвобождения в системах и для снижения их быстрой элиминации из кровотока. Более того показано, что смешивание полимеров и гистонов обеспечивает синергизм между двумя компонентами и этот эффект улучшает эффективность трансфекции гена [19].

В патенте RU 2670512 С2 [40] описан способ приготовления многослойных наночастиц для трансфекции клеток агентами для модификации экспрессии генов. Комплексы полинуклеотидов с полимерами, или полиплексы, созданные путем конденсации катионных полимеров и полинуклеотидов в присутствии анионных полимеров, могут опосредовать увеличенную эффективность трансфекции относительно конъюгатов полинуклеотида-катионного полимера.

Способ предусматривает создание ядра полиплекса наночастиц, которое включает полинуклеотид, анионный полимер, катионный полимер, и катионный полипептид. Полинуклеотидом является вектор ДНК для запуска внутриклеточной экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, которую он содержит.

Анионный полимер в полиплексе представлен полиглутаминовой кислотой. Катионный полимер включает поли(L-аргинин) с молекулярной массой приблизительно 29 кДа.

Наночастицы включают обратимое покрытие, которое обеспечивает стабильность ядра полиплекса перед интернализацией в клетку или ее отделы, предотвращая преждевременное разрушение или дестабилизацию. Покрытие из диоксида кремния наносят на ядро полиплекса.

Наночастицы включают слой полиаргинина 10 кДа, связанного с наружной поверхностью из диоксида кремния. Добавление покрытия катионного полимера на покрытие из диоксида кремния позволяло получать наночастицы диаметром приблизительно 170 нм. Такие многослойные наночастицы, предназначены для трансфекции клеток, включенными в их состав агентами для модификации экспрессии генов.

Известен способ получения плотных липидных наночастиц (SLN, Solid Lipid Nanoparticles), которые используют в качестве платформы для доставки нуклеиновых кислот в качестве терапевтических агентов [41]. Катионные SLN как заряженные молекулярные носители возможно представляют некоторые технологические преимущества такие как сохранение стабильности, относительно простой способ получения, без использования органических растворителей, возможность проведения стерилизации и лиофилизации продукта, получение наночастиц в большом масштабе. Более того, при получении SLN используют физиологические ингредиенты, которые уже одобрены для фармакологического применения у человека.

SLN могут быть получены для использования как наночастицы и при смешивании с ДНК могут конденсировать нуклеиновую кислоту на поверхности частиц при электростатическом взаимодействии с положительно заряженной поверхностью.

Комплексы SLN/нуклеиновая кислота предохраняют нуклеиновую кислоту от ферментативной деградации и доставляют генетический материал в клетки при взаимодействии с негативно заряженной клеточной мембраной. Эти системы доставки используют для направления плазмиды на мишень, способствуют клеточной стабильности плазмиды и при поглощении ядром клетки для стимулирования трансфекционной эффективности. Дальнейший эффект SLN при введении генетического материала in vivo будет зависеть от их способности эффективно преодолевать физиологические барьеры, избирательно доставлять генетический материал к определенным типам клеток для экспрессии терапевтических генов.

Для успешной доставки гена в ядро клетки идеальные катионные наносферы имеют следующие характерные черты.

Во-первых, они должны обладать достаточно высокой способностью нагрузки (scale up), то есть завершенное формулирование должно иметь высокую эффективность нагрузки ДНК для максимальной доставки полезного груза.

Во-вторых, размер полученного комплекса катионный полимер - ДНК должен иметь размер в пределах нанометров для оптимальной интернализации в клетки.

В-третьих, комплексы катионных наносфер с ДНК должны обладать избыточным оптимальным суммарным положительным поверхностным зарядом для взаимодействия с негативно заряженной мембраной клетки.

В-четвертых, комплекс, сформированный между ДНК и катионными наносферами, должен защищать «полезный груз» от ферментативной деградации.

В патентах №2396342 С1 РФ [42], №2647466 С1 РФ [43] и №2722822 РФ [44] описаны способы получения положительно заряженных полимерных резорбируемых наносфер диаметром не более 1000 нм на основе кристаллизованного декстрана, покрытых разными типами гистонов.

Микросферы диаметром не более 1000 нм, покрытые разными типами гистонов, использовали для модификации поверхностей, предназначенных для культивирования клеток [42, 43]. Модификация поверхности микросфер экзогенными гистонами способствовала их электростатическому связыванию с клетками.

Перспективы использования гистоновых наносфер диаметром не более 1000 нм, касающиеся возможности их применения для топографической модификации поверхностей, предназначенных для трехмерного культивирования клеток in vitro рассмотрены в обзорах [45, 46].

Известен способ получения нативного белка пролонгированного действия в составе полимерных резорбируемых наносфер на основе кристаллизованного декстрана диаметром не более 200 нм, покрытых гистонами для доставки, который является близким по технической сущности предлагаемому изобретению и выбран в качестве прототипа [44].

Известный состав включает наносферы, которые получают на основе декстрана и водного раствора белка, в качестве которого используют сублимационно высушенный препарат суммарного гистона животного происхождения, представляющий собой комплекс катионных белков, который растворяют, затем водный раствор суммарного гистона добавляют в равном объеме к водному раствору декстрана 6%-ной концентрации с молекулярной массой от 50 до 70 кДа, затем полученный раствор добавляют в органическую жидкость, представляющую собой растительное масло, в которую предварительно добавляют неионный детергент Span-80 и получают суспензию несмешивающихся жидкостей, которую перемешивают и подвергают ультразвуковой обработке, затем суспензию центрифугируют, затем осадок высушивают и получают резорбируемые наносферы диаметром не более 200 нм, содержащие в составе матрикса суммарный гистон, причем содержание белка составляет от 5,0 до 8,0 мг на 1,0 г наносфер, затем такие наносферы модифицируют белком, в качестве которого используют коровые гистоны, представляющие собой комплекс катионных белков, которые ковалентно связывают с поверхностью наносфер, причем предварительно проводят активацию наносфер, которую осуществляют добавлением к водной суспензии наносфер сшивающего агента, в качестве которого используют бромциан в количестве 10 мг на 1,0 г наносфер в присутствии триэтиламина, при температуре не более 4°С и времени инкубации не более 2 мин, затем активированные наносферы осаждают при центрифугировании, осадок промывают ацетоном и дистиллированной водой и центрифугируют, затем проводят суспендирование наносфер в растворе коровых гистонов при весовом соотношении белка и наносфер, равном 1:100, а реакцию ковалентного связывания осуществляют при рН 7,5-8,0, температуре не более 4°С, времени инкубации не более 2 ч, затем наносферы с ковалентно связанными гистонами осаждают центрифугированием, и высушивают, и получают наносферы, содержащие не менее 50 мкг коровых гистонов на 1,0 г наносфер, с получением резорбируемых наносфер диаметром не более 200 нм, содержащих нативный белок в составе матрикса наносфер и белок, иммобилизованный на поверхности наносфер, и такие наносферы используют в качестве основы для направленной доставки нативного белка к ткани-мишенй при интраназальном введении.

Недостатком известного способа приготовления наносфер, покрытых гистонами является факт, что определенные условия, например, использование ультразвуковой обработки суспензии препятствует включению плазмидной ДНК в интактной форме в матрикс наносфер для дальнейшего использования плазмидной ДНК в качестве терапевтического средства.

Заявляемое изобретение лишено указанных недостатков благодаря получению наносфер диаметром не более 200 нм на основе декстрана, и покрытию таких наносфер белковым комплексом, в качестве которого используют коровые гистоны для получения гидрофильных наносфер, несущих положительные заряды на их поверхности. За счет электростатического взаимодействия положительно заряженных аминогрупп молекул гистонов с отрицательно заряженным остовом молекулы плазмидной ДНК на поверхности наносфер формируется макромолекулярный комплекс.

Техническим результатом заявленного изобретения является сохранение нативной структуры плазмидной ДНК электростатически связанной с поверхностью декстрановых наносфер диаметром не более 200 нм и формирование макромолекулярного комплекса в их составе, повышение надежности и упрощение способа включения плазмидной ДНК в состав наносфер и имеет ряд преимуществ, которые обусловлены в основном тем, что:

1) получение наносфер, покрытых гистонами, обеспечивает электростатическое взаимодействие с кольцевой плазмидной ДНК за счет присутствия в молекулах коровых гистонов специфических последовательностей, так называемых последовательностей ядерной локализации;

2) ассоциацию ДНК с преформированными наносферами можно проводить непосредственно перед их применением, поэтому как наносферы, так и кольцевую плазмидную ДНК приготавливают заранее и сохраняют в лиофильно высушенном и замороженном состоянии соотвественно;

3) биодеградируемые декстрановые наносферы диаметром не более 200 нм, содержащие кольцевую плазмидную ДНК, предназначены для интраназального введения.

При этом допускают, что высвобождение кольцевой плазмидной ДНК при резорбции наносфер может происходить в мукозном слое обонятельной слизистой оболочки, из которого кольцевая плазмидная ДНК будет абсорбироваться параклеточно или трансклеточно в подлежащий эпителий слизистой оболочки. Дальнейшее поступление кольцевой плазмидной ДНК может осуществляться по обонятельному эпителиальному маршруту в обонятельные луковицы и из них с помощью нейрональных проводящих путей в ЦНС [48-50]. Это подтверждается результатами исследований по изучению проникновения в ЦНС плазмидной ДНК и препарата суммарного гистона при внутривенном и интраназальном введении [51-53].

В исследовании [51] установлено, что плазмиды pCMVβ 7,2 kb и pN2/CMVβ 14,2 kb, которые кодирут ген β - галактозидазы были обнаружены в ткани мозга в пределах 15 мин после интраназального введения, β - галактозидазная активность была достаточно высокой в гомогенатах ткани мозга через 48 ч после введения.

Кинетические исследования показали, что при интраназальном введении плазмидная ДНК (pDNA) достигает ткань мозга с эффективностью почти в 2,6 раза большей, чем при внутривенном введении pDNA через 10 мин после введения. При этом pCMVβ была обнаружена в 9-ти областях ткани мозга: обонятельных луковицах, септальной области, полосатом теле, гипоталамусе, таламусе, среднем мозге, гиппокампе, продолговатом мозге и мозжечке после интраназального и внутривенного введения.

При внутривенном введении pDNA имела одинаковые уровни в различных областях мозга, тогда как при интраназальном введении обнаружены разные уровни распределения pDNA среди 9-ти областей мозга. Количественное определение абсорбции (поглощения) и распределения pDNA в крови и ткани мозга проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

В исследовании показано, что небольшие по размеру pDNA (7,2 kb) обладают высокой системной абсорбцией и может достаточно легко проходить через назальную эпителиальную мембрану. Хотя системная абсорбция pDNA повышается в течение первых 2 ч, уровни pDNA также были высокими через 4 ч после введения. Различие между системной абсорбцией и скоростью распределения в ткани мозга поддерживает мнение, что при интраназальном введении pDNA может достигать ткани мозга путем прямого несистемного маршрута. Это подтверждают данные изменения уровней распределения pDNA в 9-ти различных областях мозга после интраназального и внутривенного введения.

Однако различные паттерны регионального распределения pDNA на ранних (5 мин) и поздних (60 мин) временных точках после интраназального и внутривенного введения подразумевают, что основная часть pDNA в ткани мозга после интраназального введения может представлять собой прямую абсорбцию из назальной каверны, а не из системной циркуляции. Более того, высокие уровни pDNA в обонятельных луковицах после интраназального введения и высокие уровни pDNA во всех временных точках поддерживают мнение, что обонятельные луковицы могут играть важную роль в абсорбции pDNA интраназально введенной в ткань мозга. Эти данные позволяют предполагать, что интраназальное введение pDNA посредством прямого маршрута via обонятельные луковицы может быть альтернативным способом для эффективной доставки pDNA в ткань мозга.

Проницаемость меченного ¹²⁵I -суммарного гистона из ткани тимуса телят через ГЭБ в паренхиму мозга крыс после его введения в сонную артерию анестезированных животных изучена в опытах in vivo [52]. В этом исследовании использовали гисторадиоавтографический способ оценки проникновения гистонов в соответствующие области мозга. При анализе морфологической локализации экзогенных гистонов в ткани мозга выявлено интенсивное насыщение мечеными гистонами сосудистого сплетения III желудочка мозга. «Метка» была локализована вдоль поверхности эндотелиальной выстилки; «треки» наблюдали в зоне как плазматической, так и базальной мембраны. Эти наблюдения указывают на возможность поступления меченых гистонов в ткань мозга из III желудочка. Значительное и практически одинаковое количество «треков» гистонов зафиксировано в нервной ткани гиппокампа и гипоталамуса. Проникновение меченых гистонов в область сенсомоторной коры было ниже, чем в другие названные выше отделы мозга. В исследованиях [53] установлено поступление в обонятельные луковицы препарата суммарного гистона при интраназальном введении мышам. Показано, что после интраназального введения меченного ¹²⁵I - суммарного гистона в первые 15 мин содержание радиоактивного гистона в обонятельных луковицах было почти в 2 раза выше, чем в крови, и в 40 раз выше, чем в коре больших полушарий. Картина распределения радиоактивной метки при интраназальном введении гистонов предполагает два независимых канала поступления в различные ткани животного. Попадание ¹²⁵I - суммарного гистона в кровь может осуществляться через капиллярную сеть респираторного эпителия носовой полости, которая чрезвычайно развита. Другая часть радиоактивного гистона может непосредственно транспортироваться в обонятельные луковицы с помощью аксоплазматического транспорта по волокнам обонятельных нейронов. Поступление гистонов в другие отделы мозга может иметь вторичный характер и быть опосредовано транспортом через кровеносную систему при условии, что молекулы меченого гистона способны проникать через ГЭБ.

Технический результат достигается тем, что в известном способе получения и использования нативного белка в составе полимерных и резорбируемых наносфер, пригодного для пролонгированного высвобождения при доставке, который включает известные и общие с заявленным способом признаки, где состав содержит белок, в качестве которого используют сублимационно высушенный препарат коровых гистонов животного происхождения, представляющий собой комплекс катионных белков, который растворяют до 0,1%-ной концентрации в дистиллированной воде, затем водный раствор белка добавляют в равном объеме к водному раствору декстрана 6%-ной концентрации с молекулярной массой от 50 до 70 кДа, затем полученный раствор добавляют в органическую жидкость, в которую предварительно добавляют неионный детергент Span-80 до конечной концентрации 0,5%, причем в качестве органической жидкости используют растительное масло в количестве 3,5 объема от объема исходного раствора и получают суспензию несмешивающихся жидкостей, смесь перемешивают и подвергают ультразвуковой обработке в течение 5 мин при мощности 75 Вт, затем полученную суспензию центрифугируют, а центрифугирование проводят в течение 5±1 мин при 2000 x-g, затем осадок обрабатывают ацетоном и повторно центрифугируют и высушивают при комнатной температуре и получают резорбируемые наносферы диаметром не более 200 нм, содержащие в составе матрикса коровые гистоны, причем содержание белка составляет от 5,0 до 8,0 мг на 1,0 г наносфер, затем такие наносферы модифицируют белком, в качестве которого используют препарат коровых гистонов, представляющие собой комплекс катионных белков, которые предварительно растворяют до 0,1%-ной концентрации в 0,01 М фосфатном буферном растворе, рН 7.0, и которые ковалентно связывают с поверхностью наносфер, причем предварительно проводят активацию наносфер, которую осуществляют добавлением к водной суспензии наносфер сшивающего агента, в качестве которого используют бромциан в количестве 10 мг на 1,0 г наносфер в присутствии триэтиламина, при температуре не более 4°С и времени инкубации не более 2 мин, затем активированные наносферы, содержащие активные имидокарбонатные группы, осаждают при центрифугировании, и осадок последовательно промывают три раза ацетоном и два раза дистиллированной водой при центрифугироавнии, после чего проводят суспендирование наносфер в 0,1%-ом растворе коровых гистонов при весовом соотношении 5,0 мг гистона на 1,0 г наносфер, а реакцию ковалентного связывания осуществляют в 0,02 М фосфатном буферном растворе, рН 7,8-8,0, при температуре не более 4°С, времени инкубации не более 2 ч при перемешивании, затем наносферы с ковалентно связанными коровыми гистонами осаждают центрифугированием, отмывают от избытка гистонов тем же фосфатным буферным раствором и высушивают при комнатной температуре и получают наносферы, содержащие не менее 50 мкг ковалентно связанных коровых гистонов на 1,0 г наносфер с получением резорбируемых наносфер диаметром не более 200 нм, содержащих нативный белок в составе матрикса наносфер и белок, иммобилизованный на поверхности наносфер, затем к таким наносферам добавляют кольцевую плазмидную ДНК, содержащую не более 800 пар нуклеотидов, для этого 1,0 г наносфер с ковалентно связанными гистонами суспендируют в 2,0 мл буферного раствора, содержащего 100 мМ NaCl и 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, в который вносят 10,0 мкг на 1,0 г наносфер кольцевую плазмидную ДНК, которую предварительно растворяют до 0,01%-ной концентрации в дистиллированной воде и затем инкубируют при 4°С в течение 10 ч, при этом происходит ковалентное связывание кольцевой плазмидной ДНК с доступными активными имидокарбонатными группами на поверхности наносфер, наряду с электростатическим взаимодействием с молекулами коровых гистонов, затем такие наносферы с ковалентно связанными гистонами и кольцевой плазмидной ДНК осаждают при центрифугировании для удаления несвязанной кольцевой плазмидной ДНК и получают наносферы диаметром не более 200 нм, содержащие не менее 4,0 мкг кольцевой плазмидной ДНК на 1,0 г наносфер, иммобилизованной на поверхности наносфер, покрытых коровыми гистонами, и полученные резорбируемые наносферы предназначены для доставки кольцевой плазмидной ДНК к ткани-мишени при интраназальном введении.

Таким образом, предварительное включение белка, представляющего комплекс положительно заряженных коровых гистонов в матрикс резорбируемых декстрановых наносфер диаметром не более 200 нм, обеспечивает сохранение нативной структуры белка.

Последующую модификацию поверхности наносфер коровыми гистонами проводят после активации наносфер с получением наносфер, содержащих активные имидокарбонатные группы, с которыми ковалентно связываются коровые гистоны.

В исследовании [44], который выбран в качестве прототипа, был проведен анализ морфологии клеток, культивированных на наносферах, покрытых гистонами и нанесенных на поверхность культуральных сосудов.

В этом исследовании на основании результатов сканирующей электронной микроскопии был установлен диаметр наносфер, покрытых гистонами и проведен анализ прикрепления, распластывания и роста клеток при культивировании на поверхности субстрата, покрытого наносферами и нанесенного на поверхность культуральных сосудов.

Результаты сканирующей электронной микроскопии представлены на Фигуре [44].

На фиг. видно, что наносферы имеют диаметр не более 200 нм, и формируют на поверхности субстрата равномерный, однородный, плотный слой (области темно-серого цвета).

Для исследования адгезии, роста и морфологии клеток использовали постоянную линию спонтанно трансформированных эмбриональных фибробластов мыши BALB 3Т3, клон А31.

На фиг. видно, что клетки распластаны на поверхности наносфер (области темного цвета), лишь в некоторых случаях наблюдаются отростки, связывающие близко лежащие клетки.

Такой характер поведения клеток, посаженных на наносферы диаметром не более 200 нм, покрытых гистонами, в значительной степени, отличается от поведения клеток, посаженных на наносферы диаметром не более 1000 нм, покрытых гистонами разного типа.

Наносферы диаметром не более 1000 нм способствуют гораздо большей распластанности клеток, образованию ими плотных межклеточных контактов, наличием большого числа отростков, с помощью которых формируются длинные клеточные цепи. Было установлено, микросферы диаметром 1000 нм, покрытые гистонами разного типа, могут быть использованы в дальнейшем при создании трехмерных пористых матриц, предназначенных для формирования в них тканеподобных клеточных структур in vitro [45].

Резорбируемые наносферы диаметром не более 200 нм на основе декстрана, покрытых гистонами, предназначенны для их использования в системах мукоадгезивной доставки белковых терапевтических средств, включенных в состав наносфер в процессе их получения.

Такие мукоадгезивные системы, содержащие гистоны, иммобилизованные на поверхности наносфер диамтером не более 200 нм могут быть использованы для сайт-специфической доставки включенного белка к мишени (органу или ткани), например, при интраназальном введении, и подробно рассмотрены в обзоре [47].

Наряду с этими данными в предлагаемом изобретении установлено, что такие наносферы представляют платформу для ковалентного связывания кольцевой плазмидной ДНК с доступными имиднокарбонатными группами на поверхности наносфер и с молекулами гистонов при электростатическом взаимодействии. Такие наносферы с иммобилизованной на поверхности наносфер кольцевой плазмидной ДНК предназначены для доставки кольцевой плазмидной ДНК к ткани-мишени при интраназальном введении.

Высвобождение белка, включенного в матрикс наносфер и иммобилизованной на поверхности наносфер кольцевой плазмидной ДНК из резорбируемых наносфер в назальной полости предусматривает непосредственный транспорт макромолекул с помощью аксоплазматического транспорта по волокнам обонятельных нейронов к ткани-мишени.

Результаты проведенных исследований поясняются следующими примерами.

Пример 1.

Эта серия экспериментов направлена на подтверждение способа включения белка в состав матрикса полимерных наносфер диаметром не более 200 нм при осуществлении предлагаемого изобретения.

Способ получения биологически активного белка в составе полимерных наносфер предусматривает использование стабильной полимерной суспензии двух несмешивающихся жидкостей (водный раствор - органическая жидкость), в качестве которых используют водный раствор декстрана, содержащий белковый препарат (дисперсионная фаза) и органическую жидкость, в качестве которой используют растительное масло (непрерывная фаза).

В качестве модельного белка используют препарат коровых гистонов. Препараты коровых гистонов, содержащие гистоны Н2А, Н2В, Н3, Н4 получают известным способом [55].

В конкретном случае способ осуществляют следующим образом. Приготавливают водный раствор декстрана и водный раствор белка, причем используют сублимационно высушенный препарат коровых гистонов, который растворяют до 0,1%-ной концентрации в дистиллированной воде, затем водный раствор препарата коровых гистонов добавляют в равном объеме к водному раствору декстрана 6%-ной концентрации с молекулярной массой от 50 до 70 кДа, затем раствор, содержащий декстран и коровые гистоны, выдерживают в течение 30±5 мин при температуре 6±2°С, затем этот раствор добавляют в органическую жидкость, в которую предварительно добавляют неионный детергент Span-80 до конечной концентрации 0,5%, причем в качестве органической жидкости используют растительное масло в количестве 3,5 объема от объема исходного раствора, и получают смесь двух несмешивающихся жидкостей, которую перемешивают и повторно выдерживают в течение 30±5 мин при температуре 6±2°С, и получают суспензию, затем суспензию подвергают ультразвуковой обработке, в течение 5,0 мин при мощности 75 Вт, затем полученную суспензию центрифугируют в течение 5±1 мин при 2000 g, затем осадок высушивают при комнатной температуре и получают резорбируемые наносферы диаметром не более 200 нм, содержащие в составе матрикса коровые гистоны, причем содержание белка составляет от 5,0 до 8,0 мг на 1,0 г наносфер.

Определение количества белка, включенного в наносферы, осуществляют с помощью аминокислотного анализа [56]. Декстрановые наносферы, содержащие включенные в матрикс коровые гистоны, высушивают до постоянного веса при 50°С. В качестве стандарта используют препарат коровых гистонов. Образцы гидролизуют 6 н. хлористо-водородной кислотой в течение 24 ч при 110°С.

После высушивания образцов до постоянного веса проводят аминокислотный анализ и рассчитывают количество белка. Количество белка оценивают на основании данных по содержанию в гидролизатах устойчивых к гидролизу аминокислот, таких как аспарагиновая кислота, глицин, глутаминовая кислота.

Количество коровых гистонов в составе матрикса наносфер диаметром не более 200 нм составляет от 5,0 до 8,0 мг на 1 г наносфер.

Пример 2.

Эта серия экспериментов направлена на подтверждение способа модификации поверхности наносфер диаметром не более 200 нм коровыми гистонами при осуществлении предлагаемого изобретения.

Способ модификации поверхности наносфер диаметром не более 200 нм предусматривает проведения ряда последовательных этапов. Приготавливают водный раствор декстрана 6%-ной концентрации с молекулярной массой от 50 до 70 кДа, затем раствор, содержащий декстран, выдерживают в течение 30±5 мин при температуре 6±2°С, затем этот раствор добавляют в органическую жидкость, в которую предварительно добавляют неионный детергент Span-80 до конечной концентрации 0,5%, причем в качестве органической жидкости используют растительное масло в количестве 3,5 объема от объема исходного раствора, и получают суспензию несмешивающихся жидкостей, которую перемешивают и повторно выдерживают в течение 30±5 мин при температуре 6±2°С, затем суспензию подвергают ультразвуковой обработке, затем полученную суспензию центрифугируют в течение 5±1 мин при 2000g, затем осадок высушивают при комнатной температуре и получают резорбируемые наносферы диаметром не более 200 нм.

Образец наносфер в количестве 100 мг суспендируют в 1.0 мл дистиллированной воды и помещают в ледяную баню. Перед иммобилизацией коровых гистонов на поверхности наносфер проводят предварительную активацию наносфер сшивающим агентом, в качестве которого используют бромциан в присутствии триэтиламина. Для этого к суспензии наносфер добавляют 1,0 мг бромциана при интенсивном перемешивании и выдерживают в течение двух минут.Активированные наносферы промывают ацетоном три раза (3×12 мл) и два раза дистиллированной водой (2×12 мл) при центрифугировании. После последнего центрифугирования к активированным наносферам добавляют 1.0 мл 0,1% раствора коровых гистонов в 0,02 М фосфатно-солевом буфере рН 7,8-2,0. Полученную вторичную суспензию наносфер при весовом соотношении белка и наносфер, равном 1:100, инкубируют при 4°С в течение 2 ч при перемешивании для ковалентного связывания коровых гистоновых с наносферами, содержащими имидокарбонатные группы на поверхности наносфер. Наносферы с ковалентно связанным белком осаждают из суспензии при повторном центрифугировании и отмывают от избытка гистонов тем же самым фосфатным буферным раствором и высушивают при комнатной температуре.

Определение количества белка, иммобилизованного на поверхности наносфер, осуществляют с помощью аминокислотного анализа (56). Наносферы (50 мг), ковалентно связанные с коровыми гистонами, высушивают до постоянного веса при 50°С. В качестве стандарта используют препарат коровых гистонов (10 мг). Оба образца гидролизуют 6 н. хлористо-водородной кислотой в герметических пробирках в течение 24 ч при 110°С. После высушивания образцов до постоянного веса проводят аминокислотный анализ и рассчитывают количество белка.

Количество белка оценивают на основании данных по содержанию в гидролизатах устойчивых к гидролизу аминокислот, таких как аспарагиновая кислота, глицин, глутаминовая кислота.

Количество ковалентно связанных коровых гистонов с поверхностью наносфер диаметром не более 200 нм составляет не менее 50 мкг ковалентно связанного белка на 1,0 г наносфер.

Пример 3.

Эта серия экспериментов направлена на подтверждение способа иммобилизации плазмидной ДНК на поверхности наносфер диаметром не более 200 нм при осуществлении предлагаемого изобретения.

В данном случае предусмотрено использование полимерных наносфер, содержащих комплекс катионных белков в составе матрикса и на поверхности наносфер, в качестве платформы для иммобилизации на их поверхности кольцевой плазмидной ДНК для направленной доставки к ткани-мишени.

Получают резорбируемые наносферы на основе декстрана диаметром не более 200 нм, содержащие в составе матрикса наносфер коровые гистоны, причем содержание белка составляет 5-8 мг белка на 1,0 г наносфер. Затем поверхность таких наносфер модифицируют коровыми гистонами. Для этого предварительно проводят активацию наносфер с получением наносфер, содержащих имидокарбонатные группы на их поверхности, с которыми ковалентно связывают коровые гистоны и получают наносферы, содержащие не менее 50 мкг иммобилизованного белка на 1,0 г наносфер.

В конкретном случае такие активированные наносферы, содержащие имидокарбонатные группы, используют в качестве платформы для иммобилизации на их поверхности кольцевой плазмидной ДНК, для этого 1,0 г наносфер с ковалентно связанными гистонами суспендируют в 2,0 мл буферного раствора, содержащего 100 мМ NaCl и 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, в который вносят кольцевую плазмидную ДНК в количестве 10,0 мкг на 1,0 г наносфер. Для этого препарат кольцевой плазмидной ДНК предварительно растворяют до 0,01%-ной концентрации в дистиллированной воде, и в суспензию вносят 100 мкл раствора, содержащего 10,0 мкг препарата ДНК, и затем инкубируют при 4°С в течение 10 ч, при этом происходит ковалентное связывание кольцевой плазмидной ДНК с доступными активными имидокарбонатными группами на поверхности наносфер, наряду с электростатическим взаимодействием с молекулами коровых гистонов, затем такие наносферы с ковалентно связанными гистонами и кольцевой плазмидной ДНК осаждают при центрифугировании для удаления несвязанной кольцевой плазмидной ДНК и получают наносферы диаметром не более 200 нм, содержащие не менее 4,0 мкг кольцевой плазмидной ДНК на 1,0 г наносфер, иммобилизованной на поверхности наносфер, покрытых коровыми гистонами, и полученные резорбируемые наносферы предназначены для доставки кольцевой плазмидной ДНК к ткани-мишени при интраназальном введении.

В качестве модельного препарата кольцевой плазмидной ДНК используют плазмидный экспрессионный вектор pRh15A, который получают известным способом [54]. Препарат плазмидного вектора pRh15A представляет кольцевую плазмидную ДНК, содержащую не более 800 п.н.

Количество плазмидной ДНК, иммобилизованной на поверхности наносфер, определяют по разности между количеством внесенного препарата ДНК в среду инкубации, содержащей наносферы и количеством несвязавшейся ДНК, которую определяют в растворе после осаждения наносфер при центрифугировании.

Концентрацию препарата плазмидной ДНК измеряют спектрофотометрическим способом по поглощению раствора препарата ДНК при длине волны 260 нм, используя молярный коэффициент поглощения (ε), который устанавливают предварительно. Для этого образец препарата ДНК растворяют в дистиллированной воде до конечной концентрации 1 мг в 1 мл и определяют поглощение при длине волны 260 нм. Раствор образца препарата плазмидной ДНК при 260 нм имел поглощение 50 оптических единиц. Исходя из уравнения С=А₂₆₀×ε, где А₂₆₀ - количество света, который поглощается при длине волны 260 нм и составляет 50 оптических единиц. По расчету ε составляет 0,02 (мг^-1 см^-1 мл) или 0,02 (мл/мг см), ε=С/А₂₆₀, то есть ε=1 мг ДНК/50 оптических единиц и равен 0,02. Коэффициент поглощения означает, что ДНК с концентрацией 1 мг/мл соответствует 50 оптическим единицам при 260 нм, то есть С_{препаратаДНК}=50×0,02 мг/мл.

Чистоту препарата ДНК оценивают по измерению соотношения А_260/280. На высокую чистоту образца ДНК указывает отношение А_260/280 в пределах 1,8-1,9.

Как показывают примеры конкретной реализации заявленный способ получения плазмидной ДНК в составе полимерных наносфер для доставки обеспечивает сохранение нативной структуры плазмидной ДНК при ковалентном связывании с поверхностью декстрановых наносфер диаметром не более 200 нм наряду с электростатическим взаимодействием с молекулами гистонов и формированием макромолекулярного комплекса в их составе, повышение надежности и упрощение способа включения плазмидной ДНК в состав резорбируемых наносфер, что обеспечивает высвобождение плазмидной ДНК и белка и предусматривает непосредственный транспорт этих макромолекул к ткани-мишени.

Список используемой литературы

1. Е А Епифанова, Е.В. Борисова, В.А. Салина, А.А. Бабаев. (2017) Вирусные векторы для доставки генетического материала в клетку и их использование в нейробиологии (обзор). Современные технологии в медицине. 9(1): 162-174.

2. Апарцин Е.К., Кнауэр Н.Ю. (2016) Методы доставки генетического материала в клетки и возможности их применения в генной терапии. Гены & Клетки: Том XI, №2, стр.: 32-41.

3. О.А. Безбородова, Е.Р. Немцова, Р.И. Якубовская, А.Д. Каприн. (2016) Генная терапия - новое направление в медицине. Онкология. Журнал им. П.А. Герцена. 5(2): 64-72

4. de Morais MG, Martins VG, Steffens D, et al. (2014) Biological applications of nanobiotechnology. J Nanosci Nanotechnol 14: 1007-1017.

5. Wang W, Li W, Ma N, et al. (2013) Non-viral gene delivery methods. Curr Pharm Biotechnol 14: 46-60.

6. Jin L, Zeng X, Liu M, et al. (2014) Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics 4: 240-255.

7. Pack DW, Hoffman AS, Pun S, et al. (2005) Design and development of polymers for gene delivery. Nat Rev Drug Discov 4: 581-593.

8. Gao X, Kim KS, Liu D. (2007) Nonviral gene delivery: what we know and what is next. AAPS J 9: E92-104.

9. Morille M, Passirani C, Vonarbourg A, et al. (2008) Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy against cancer. Biomaterials 29: 3477-3496.

10. Milad Soleimani, Maxime Merheb, Rachel Matar. (2015) Human gene therapy - the future of health care. Hamdan Medical Journal 8(1): 101-110.

11. Upasana Sharma, Pragya Nand Badyal, Swati Gupta. (2015) Polymeric Nanoparticles Drug Delivery to Brain: A Review. Int J Pharmacol Pharm Sci 2: 5; 60-69.

12. Blanco E, Shen H, Ferrari M. (2015) Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol 33: 941-951.

13. Milad Soleimani, Aaesha Majid Al Zaabi, Maxime Merheb, Rachel Matar. (2016) Nanoparticles in Gene Therapy. International Journal of Integrative Biology 17(1): 7-16.

14. Pérez-Martínez FC, Guerra J, Posadas I, et al. (2011) Barriers to non-viral vector-mediated gene delivery in the nervous system. Pharm Res 28: 1843-1858.

15. Feigner PL, Barenholz Y, Behr JP, et al. (1997) Nomenclature for synthetic gene delivery systems. Hum Gene Ther 8: 511-512.

16. Balagurumoorthy P, Adelstein SJ, Kassis AI. (2008) Method to eliminate linear DNA from mixture containing nicked circular, supercoiled, and linear plasmid DNA. Anal Biochem 381: 172-174.

17. Li L, Wei Y, Gong C. (2015) Polymeric Nanocarriers for Non-Viral Gene Delivery. J Biomed Nanotechnol 11: 739-770.

18. Pouton CW. (1998) Nuclear import of polypeptides, polynucleotides and supramolecular complexes. Adv Drug Deliv Rev 34: 51-64.

19. Han H, Yang J, Chen W, et al. (2019) A comprehensive review on histone-mediated transfection for gene therapy. Biotechnol Adv 37: 132-144.

20. Wagstaff KM, Fan JY, De Jesus MA, et al. (2008) Efficient gene delivery using reconstituted chromatin enhanced for nuclear targeting. FASEB J 22: 2232-2242.

21. Wagstaff KM, Glover DJ, Tremethick DJ, et al. (2007) Histone-mediated transduction as an efficient means for gene delivery. Mol Ther 15: 721-731.

22. Kaouass M, Beaulieu R, Balicki D. (2006) Histonefection: Novel and potent non-viral gene delivery. J Control Release 113: 245-254.

23. De Mesmaeker A, Altmann KH, Waldner A, et al. (1995) Backbone modifications in oligonucleotides and peptide nucleic acid systems. Curr Opin Struct Biol 5: 343-355.

24. Haberland A, Böttger M. (2005) Nuclear proteins as gene-transfer vectors. Biotechnol Appl Biochem 42: 97-106.

25. Cartier R, Reszka R. (2002) Utilization of synthetic peptides containing nuclear localization signals for nonviral gene transfer systems. Gene Ther 9: 157-167.

26. Neves C, Escriou V, Byk G, et al. (1999) Intracellular fate and nuclear targeting of plasmid DNA. Cell Biol Toxicol 15: 193-202.

27. Ciolina C, Byk G, Blanche F, et al. (1999) Coupling of nuclear localization signals to plasmid DNA and specific interaction of the conjugates with importin alpha. Bioconjug Chem 10: 49-55.

28. Pouton CW, Wagstaff KM, Roth DM, et al. (2007) Targeted delivery to the nucleus. Adv Drug Deliv Rev 59: 698-717.

29. Ganta S, Devalapally H, Shahiwala A, et al. (2008) A review of stimuli-responsive nanocarriers for drug and gene delivery. J Control Release 126: 187-204.

30. Sebestyén MG, Ludtke JJ, Bassik MC, et al. (1998) DNA vector chemistry: the covalent attachment of signal peptides to plasmid DNA. Nat Biotechnol 16: 80-85.

31. Tanimoto M, Kamiya H, Minakawa N, et al. (2003) No enhancement of nuclear entry by direct conjugation of a nuclear localization signal peptide to linearized DNA. Bioconjug Chem 14: 1197-1202.

32. Wagstaff KM, Jans DA. (2006) Intramolecular masking of nuclear localization signals: analysis of importin binding using a novel AlphaScreen-based method. Anal Biochem 348: 49-56.

33. Vacik J, Dean BS, Zimmer WE, et al. (1999) Cell-specific nuclear import of plasmid DNA. Gene Ther 6: 1006-1014.

34. Lechardeur D, Lukacs GL. (2006) Nucleocytoplasmic transport of plasmid DNA: a perilous journey from the cytoplasm to the nucleus. Hum Gene Ther 17: 882-889.

35. Danuta Balicki, Ernest Beutler. (2004) Histone H2A - derived peptides useful in gene delivery. № US 20040102606 A1, США.

36. Prakash Chandra, Angelika Chandra, Ilhan Demirhan, Oliver Hasselmayer. (1999) Histone H2A - derived peptides useful in gene delivery. № WO 1999019502 A1, WIPO (PCT).

37. Shi Kun Huang, Edwin Kiyoshi Oto, Mohammad Hassanipour, Bei Jin. (2000) Condensed plasmid-liposome complex for transfection. № WO 2000015825 A1, WIPO (PCT).

38. Jon A. Wolff, James E. Hagstrom, Vladimir G. Budker, Jeffery Fritz. (2001) Process of transfecting a cell with a polynucleotide mixed with an amphipathic compound and a DNA-binding protein. № US 6180784 B1, США.

39. Зиновьева Марина Валерьевна, Безуглов Владимир Виленович, Грецкая Наталья Михайловна, Введенский Андрей Владимирович, Есипов Роман Станиславович, Костромина Мария Андреевна, Алексеенко Ирина Васильевна, Акопов Сергей Борисович, Свердлов Евгений Давидович. (2017) Гистоны и биодеградируемые липиды как средство для доставки нуклеиновых кислот в клетки эукариот. Патент на изобретение №2637371 С2. Российская Федерация.

40. Котха Шива Прасад (US), Уотсон Андре Роналд (US), Пандит Ваибхав А. (US). (2018) Доставка генов, опосредованная наночастицами, геномная коррекция и лиганд-направленная модификация в различных клеточных популяциях. Патент на изобретение №2670512 С2. Российская Федерация.

41. de Jesus MB, Zuhorn IS. (2015) Solid lipid nanoparticles as nucleic acid delivery system: properties and molecular mechanisms. J Control Release 201: 1-13.

42. Горюхина O.A., Мартюшин С.В., Пинаев Г.П. (2010) Способ получения трехмерных матриц для тканеподобных структур из клеток животного происхождения. Патент на изобретение №2396342 С1. Российская Федерация.

43. Ноздрачев А.Д., Горюхина О.А., Мартюшин С.В., Мищенко И.В. (2018) Способ получения нативного белка пролонгирующего действия в составе полимерных наносфер и резорбируемых микросфер для доставки. Патент на изобретение №2647466 С1. Российская Федерация.

44. Ноздрачев А.Д., Горюхина О.А., Мартюшин С.В., Мищенко И.В. (2020) Способ получения полимерных наносфер для направленной доставки к ткани-мишени. Патент на изобретение №2722822 С1. Российская Федерация (прототип).

45. Горюхина О.А., Мартюшин С.В., Блинова М.И., Полянская Г.Г., Черепанова О.А., Пинаев Г.П. (2010) Культивирование клеток на микросферах, покрытых гистонами. Цитология. 52 (1): 12-23.

46. Goryukhina О.А., Martyushin S.V., Pinaev G.P. (2011) On the possible use of exogenous histones in cell technology. Cell Biol Int 35 (12): 1189-93.

47. Ноздрачев А.Д., Горюхина O.A., Мартюшин СВ., Мищенко И.В. (2020) Перспективы использования экзогенных гистонов и катионных пептидов в молекулярной биотехнологии. Молекулярная медицина, 18, (2): 3-10.

48. Brown А. (2003) Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. J Cell Biol 160: 817-821.

49. Lochhead JJ, Thorne RG. (2012) Intranasal delivery of biologies to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev 64: 614-628.

50. Barbu E, Molnàr E, Tsibouklis J, et al. (2009) The potential for nanoparticle-based drug delivery to the brain: overcoming the blood-brain barrier. Expert Opin Drug Deliv 6: 553-565.

51. Han IK, Kim MY, Byun HM, et al. (2007) Enhanced brain targeting efficiency of intranasally administered plasmid DNA: an alternative route for brain gene therapy. J Mol Med (Berl) 85: 75-83.

52. Горюхина O.A., Илюк Р.Д., Мищенко И.В. (2000) Сравнительное исследование поступления экзогенного гистона в паренхиму головного мозга крыс.Бюлл. экспер. биол. мед. 130 (7): 63-6.

53. Гладышева О.С, Троицкая В.Т., Абрамова Н.Н., Ревитин В.Г., Горюхина О.А., Аль-Суфи Д. (1994) Сравнительное исследование транспорта экзогенного радиоактивного гистона при различных способах введения. Бюлл. Экспер. Биол. Мед. 117 (5): 484-6.

54. Кудлинг Татьяна Викторовна, Карасев Максим Михайлович, Колобов Алексей Александрович, Лисицкая Вероника Игоревна, Романов Николай Иванович, Савин Илья Игоревич, Елгина Алена Федоровна, Батарин Владимир Ильич, Горбунова Ирина Николаевна, Антипова Татьяна Олеговна, Денисенко Елизавета Сергеевна, Мартюшин Сергей Васильевич, Ищенко Александр Митрофанович. (2019) Плазмидный вектор pRh15A для получения безметионинового интерферона альфа-2b, штамм бактерий escherichia coli BL21 DE3 - продуцент безметионинового интерферона альфа-2b и способ получения безметионинового интерферона альфа-2b. Патент на изобретение №2697375 С2. Российская Федерация.

55. Горюхина О.А., Мюльберг А.А., Криева М.А., Тишкина Т.Е. (1989) Способ очистки препарата гистона Н4 из ткани тимуса телят. Патент на изобретение №1319352. Российская Федерация.

56. Lundblad, R.L. (1995) Techniques in Protein Modification, CRC Press, Boca Raton, Florida.

Настоящее изобретение относится к способу получения плазмидной ДНК в составе полимерных наносфер для доставки плазмидной ДНК к ткани-мишени при интраназальном введении. Настоящее изобретение обеспечивает сохранение нативной структуры плазмидной ДНК электростатически связанной с поверхностью декстрановых наносфер диаметром не более 200 нм и формирование макромолекулярного комплекса в их составе, повышение надежности и упрощение способа включения плазмидной ДНК в состав наносфер и имеет ряд преимуществ, которые обусловлены в основном тем, что: 1) получение наносфер, покрытых гистонами, обеспечивает электростатическое взаимодействие с кольцевой плазмидной ДНК за счет присутствия в молекулах коровых гистонов специфических последовательностей, так называемых последовательностей ядерной локализации; 2) ассоциацию ДНК с преформированными наносферами можно проводить непосредственно перед их применением, поэтому как наносферы, так и кольцевую плазмидную ДНК приготавливают заранее и сохраняют в лиофильно высушенном и замороженном состоянии соотвественно; 3) биодеградируемые декстрановые наносферы диаметром не более 200 нм, содержащие кольцевую плазмидную ДНК, предназначены для интраназального введения. 3 пр.

Способ получения плазмидной ДНК в составе полимерных наносфер для доставки, заключающийся в приготовлении водного раствора декстрана и водного раствора белка, добавлении к полученному раствору органической жидкости, получении смеси двух несмешивающихся жидкостей, ультразвуковой обработке и центрифугировании смеси, высушивании полученного осадка наносфер и последующей модификации их поверхности при ковалентном связывании с белком, где в качестве белка используют сублимационно высушенный препарат коровых гистонов животного происхождения, представляющий собой комплекс катионных белков, который растворяют до 0,1%-ной концентрации в дистиллированной воде, затем водный раствор белка добавляют в равном объеме к водному раствору декстрана 6%-ной концентрации с молекулярной массой от 50 до 70 кДа, затем полученный раствор добавляют в органическую жидкость, в которую предварительно добавляют неионный детергент Span-80 до конечной концентрации 0,5%, причем в качестве органической жидкости используют растительное масло в количестве 3,5 объема от объема исходного раствора и получают суспензию несмешивающихся жидкостей, смесь перемешивают и подвергают ультразвуковой обработке в течение 5 мин при мощности 75 Вт, затем полученную суспензию центрифугируют, а центрифугирование проводят в течение 5±1 мин при 2000g, затем осадок высушивают при комнатной температуре и получают резорбируемые наносферы диаметром не более 200 нм, содержащие в составе матрикса коровые гистоны, причем содержание белка составляет от 5,0 до 8,0 мг на 1,0 г наносфер, затем такие наносферы модифицируют белком, в качестве которого используют препарат коровых гистонов, и которые ковалентно связывают с поверхностью наносфер, причем предварительно проводят активацию наносфер, которую осуществляют добавлением к водной суспензии наносфер сшивающего агента, в качестве которого используют бромциан в количестве 10 мг на 1,0 г наносфер в присутствии триэтиламина, при времени инкубации не более 2 мин, при температуре не более 4°С и при интенсивном перемешивании, затем активированные наносферы, содержащие активные имидокарбонатные группы, последовательно промывают три раза ацетоном и два раза дистиллированной водой при центрифугировании и высушивают при комнатной температуре, после чего к активированным наносферам добавляют 1,0 мл 0,1%-ного раствора коровых гистонов в 0,02 М фосфатно-солевом буфере рН 7,8-8,0, и полученную суспензию наносфер при весовом соотношении белка:наносфер, равном 1:100, инкубируют при 4°С в течение 2 ч при перемешивании, затем наносферы с ковалентно связанными коровыми гистонами осаждают центрифугированием, отмывают от избытка гистонов тем же фосфатным буферным раствором и высушивают при комнатной температуре, и получают наносферы, содержащие не менее 50 мкг ковалентно связанных коровых гистонов на 1,0 г наносфер с получением резорбируемых наносфер диаметром не более 200 нм, содержащих нативный белок в составе матрикса наносфер и белок, иммобилизованный на поверхности наносфер, затем к таким наносферам добавляют кольцевую плазмидную ДНК, содержащую не более 800 пар нуклеотидов, для этого 1,0 г наносфер с ковалентно связанными гистонами суспендируют в 2,0 мл буферного раствора, содержащего 100 мМ NaCl и 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, в который вносят кольцевую плазмидную ДНК в количестве 10,0 мкг на 1,0 г наносфер и затем инкубируют при 4°С в течение 10 ч, при этом происходит ковалентное связывание кольцевой плазмидной ДНК с доступными активными имидокарбонатными группами на поверхности наносфер, наряду с электростатическим взаимодействием с молекулами коровых гистонов, затем такие наносферы с ковалентно связанными гистонами и кольцевой плазмидной ДНК осаждают при центрифугировании для удаления несвязанной кольцевой плазмидной ДНК и получают наносферы диаметром не более 200 нм, содержащие не менее 4,0 мкг кольцевой плазмидной ДНК на 1,0 г наносфер, иммобилизованной на поверхности наносфер, покрытых коровыми гистонами, и полученные резорбируемые наносферы предназначены для доставки кольцевой плазмидной ДНК к ткани-мишени при интраназальном введении.