СПОСОБ ОЧИСТКИ ПРЕПАРАТА ГИСТОНА Н4 ИЗ ТКАНИ ТИМУСА Советский патент 1995 года по МПК A61K38/00 C07K1/14 C07K1/16 

Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности к способам получения и очистки основных белков хроматина гистонов. Гистоны используются в модельных экспериментах при исследовании механизма взаимодействия этих белков с дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК) и негистоновыми белками в дезоксирибонуклеиновом комплексе (ДНП) или хроматине ядер тканей животных и растений, т. е. с целью изучения структуры хроматина, что является одной из основных проблем молекулярной биологии.

Цель изобретения повышение степени очистки целевого продукта за счет предотвращения его протеолитической деградации в процессе хроматографии.

Способ осуществляется следующим образом. Образец суммарного гистона сернокислого из тимуса теленка растворяют в 0,01-0,02 н. HCl. К раствору по каплям при перемешивании добавляют концентрированную хлорную кислоту до конечной концентрации 0,5 М. При этом образуется осадок нерастворимых в 0,5 М хлорной кислоте гистонов Н2А, Н2В, Н3, Н4, который отделяют от растворимого в хлорной кислоте гистона Н1 центрифугированием. Для полноты извлечения гистона Н1 осадок гистонхлоридов обрабатывают 0,5 М хлорной кислотой, взятой в 0,5-кратном объеме по отношению к объему исходного раствора. Осадок гистонхлоридов обрабатывают ацетоном, содержащем 0,02 н. серную кислоту и высушивают под вакуумом. Образец, содержащий гистоны Н2А, Н2В, Н3, Н4, растворяют в растворе следующего состава: 0,02 н. соляная кислота, 0,05 М натрий хлористый, рН 1,7. Белковый раствор подвергают хроматографическому разделению на акрилексе П-30 "Реанал, Венгрия). Хроматографию проводят при комнатной температуре. Используют колонку длиной 80-100 см и диаметром 2,0-2,5 см, в которую вносят образец из расчета 15-20 мг/см². Элюирование белка с колонки проводят исходным раствором. Скорость протекания буфера 6 мл/ч, объем фракций 3 мл. Регистрацию выхода белка с колонки осуществляют спектрофотометрически при длине волны 230 нм. Белковые фракции, соответствующие каждому белковому пику, объединяют, диализируют против 0,01-0,2 н. HCl при 4^оС и лиофилизируют.

В результате хроматографического разделения на акрилексе П-30 смеси гистонов, лишенной гистона Н1, получают три белковых пика, которые содержат в своем составе следующие классы гистонов: пик 1 смесь гистонов Н2А+Н3, пик 2 гистон Н2В, пик 3 гистон Н4.

Выход белка с колонки составляет 95% По данным электрофоретического анализа в полиакриламидном геле препарат гистона Н4 характеризуется 95-98% -ной гомогенностью. Отклонение молярных соотношений между классами гистонов по отношению к таковому в исходном препарате суммарного гистона не превышает 5-7%
Полученный предлагаемым способом препарат гистона Н4 обладает высокой бактерицидной активностью, которая наблюдается при использовании его в концентрации 10-40 мкг на 1 мл бактериальной суспензии.

П р и м е р 1. Образец суммарного гистона сернокислого (НПО "Биолар", номенклатурный N 040554) в количестве 100 мг растворяют в 20 мл 0,01 н, HCl. Раствор фильтруют через стеклянный фильтр Шотта N 1. К белковому раствору добавляют по каплям 43%-ную хлорную кислоту до конечной концентрации 0,5 М. Процедуру проводят при комнатной температуре и при постоянном перемешивании раствора на магнитной мешалке. Раствор оставляют на 10-15 мин для формирования осадка гистонхлоридов и центрифугируют. На этом этапе отделяют растворимый в 0,5 М хлорной кислоте гистон Н1. Для полноты извлечения гистона Н1 осадок гистонхлоридов один-два раза обрабатывают раствором 0,5 М хлорной кислоты, взятой в 0,5-0,6-кратном объеме по отношению к объему исходного раствора.

Осадок гистонхлоридов промывают 2-3 раза ацетоном, содержащем 0,01 н. HCl, и высушивают под вакуумом. Перед фракционированием образца, содержащего гистоны Н2А, Н2В, Н3, Н4, проводят электрофоретический анализ полученного препарата в полиакриламидном геле. Эту процедуру рекомендуется проводить для того, чтобы удостовериться в отсутствии протеиназной активности в препарате. Для этого образец растворяют в дистиллированной воде, 5М мочевине, 0,9 н. уксусной кислоте, буфере элюирования, рН 1,7, до конечной концентрации 1 мг/мл. Полученные растворы выдерживают при комнатной температуре в течение 48 ч, а другую серию идентичных растворов выдерживают при 37^оС в течение 3 ч. После окончания срока инкубации растворы для электрофоретического разделения в полиакриламидном геле обрабатывают мочевиной, уксусной кислотой, 2-меркаптоэтанолом до конечных концентраций 8 М, 0,9 н. 4% соответственно. В качестве эталона сравнения используют образец, который растворяют непосредственно перед проведением электрофореза в растворе 0,9 н. уксусной кислоты, содержащей 8 М мочевину, 4%-ный 2-меркаптоэтанол. Если после проведения электрофореза в полиакриламидном геле ни в одном из анализируемых образцов не обнаруживается продуктов деградации гистонов (на что указывает отсутствие дополнительных белковых зон на электрофореграммах между фракциями гистонов Н2А и Н4, а также впереди гистона Н4), исходный препарат можно использовать, для хроматографического разделения на акрилексе П-30. В случае отсутствия протеиназной активности 75 мг образца растворяют в 5 мл раствора следующего состава: 0,015 н.HCl, 0,05 М натрий хлористый, рН 1,7. Белковый раствор вносят в колонку, заполненную гелем акрилекс П-30, предварительно уравновешенную исходным раствором. Для хроматографического разделения используют колонку длиной 94 см и диаметром 2,5 см. Элюирование белка с колонки проводят исходным раствором. Скорость протекания буфера составляет 6 мл/ч, объем фракций 3 мл. Хроматографию проводят при комнатной температуре. Регистрацию выхода белка с колонки осуществляют спектрофотометрически при длине волны 230 нм на основании этих данных строят профиль элюции белка с колонки. Получают три белковых пика: пик 1 смесь гистонов Н2А + +Н3, пик 2 гистон Н2В, пик 3 гистон Н4. Диализ белкового пика 3 проводят при 4^оС против 40-50 объемов 0,015 н. HCl в течение 20 ч при смене раствора через каждые 5-6 ч. После диализа проводят лиофилизацию белка. Общий выход белка с колонки акрилекс П-30 составляет 95% Если выход гистона Н4 условно принять за единицу, то молярное соотношение между классами гистонов будет равно 1,50:1,03:1,03:1,00 для гистонов Н2В:H2A:H3:H4 соответственно.

На чертеже представлен профиль хроматографического разделения препарата суммарного гистона тимуса телят, предварительно лишенного гистона Н1.

П р и м е р 2. Очистку гистона Н4 проводят так же, как в примере 1 за исключением того, что используют 0,01 н.HCl при диализе. Профили хроматографического разделения препарата суммарного гистона, лишенного гистона Н1, на колонке акрилекс П-30 и результаты электрофоретического анализа конечного продукта идентичны при использовании для растворения и диализа как 0,015 н. так и 0,01 н. HCl.

П р и м е р 3. Очистку гистона Н4 проводят так же, как в примере 1, за исключением того, что при растворении и диализе используют 0,02 н. HCl. Выход и степень очистки гистона Н4 не отличаются от таковых в примере 1. При интервале значений концентрации раствора 0,01-0,02 н.HCl, против которого ведут диализ конечного продукта, растворимость гистона Н4 максимальна. При этих концентрациях соляной кислоты гистон Н4 не агрегирует (не выпадает в осадок). С другой стороны, проведение лиофилизации при столь низких концентрациях соляной кислоты не может вызвать частичного гидролиза белка.

Изобретение относится к молекулярной биологии, к способам получения и очистки основных белков хроматина гистонов. Цель изобретения повышение степени очистки целевого продукта путем предотвращения его протеолитической деградации в процессе хроматографии. Для этого образец суммарного гистона сернокислого из тимуса теленка растворяют в HC1, по каплям добавляют хлорную кислоту до конечной концентрации 0,5 М. При этом образуется осадок нерастворимых гистонов H2A, H2B,H3, H4. Его отделяют центрифугированием от растворимого в хлорной кислоте гистона H1. Образец, содержащий гистоны H2A, H2B, H3, H4, растворяют в растворе, состоящем из 0,02 H.HC1, 0,005M NaC1, pH 1,7. Проводят хроматографию при комнатной температуре на акрилексе II-30. Элюирование белка с колонки проводят исходным раствором. Регистрацию выхода белка с колонки ведут спектрофотометрически при длине волны 230. Белковые фракции, соответствующие каждому белковому пику, объединяют, диализируют против 0,01 0,02 н. HC1 при 4°С и лиофилизуют. Выход белка с колонки составляет 95% Полученный препарат обладает высокой бактерицидной активностью. 1 ил.

СПОСОБ ОЧИСТКИ ПРЕПАРАТА ГИСТОНА Н4 ИЗ ТКАНИ ТИМУСА путем растворения препарата суммарного гистона сернокислого из тимуса телят в соляной кислоте, хроматографического отделения гистона Н4, диализа и лиофилизации, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки целевого продукта за счет предотвращения его протеолитической деградации, растворенный гистон обрабатывают 0,5М раствором хлорной кислоты, полученный осадок обрабатывают ацетоном, затем растворяют его и проводят хроматографическое отделение целевого продукта на акрилексе П-30, а диализ осуществляют против 0,01 0,02 н. раствора соляной кислоты.