СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИСЛОЙНЫХ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН (БЛМ) Российский патент 2011 года по МПК G09B23/28 B01D71/00 G01N33/487 

Изобретение относится к области биологии, в частности к методам создания искусственных систем для моделирования мембран биологических клеток, и может быть использовано для медико-биологических исследований и скрининга лекарственных препаратов.

Плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ) являются давно известной удобной системой для моделирования клеточных мембран. Они позволяют изучать их электрохимические свойства, такие как распределение электрического потенциала, адсорбция ионов, строение двойного электрического слоя, влияние внешних электрических полей, ионный транспорт, а также процессы слияния, деления и т.п. [Tien H.T. Bilayer Lipid membranes (BLM): Theory and Practice. - New York: Marcel Dekker Inc. - 1974. - 655 p.].

Все известные на сегодняшний день методы получения БЛМ сводятся к двум основным: первый - нанесение на отверстие в тефлоновой перегородке капельки раствора липида в неполярном органическом растворителе (метод Мюллера-Рудина) [Mueller P., Rudin D.O., Tien H.Ti., Wescott W.С. Nature - 1962. - V.194. - P.979-980], второй - ведение двух монослоев на отверстии в тефлоновой перегородке, разделяющей две полуячейки (метод Монтала) [Takagi M., Azuma K., Kishimoto U. Annu. Rep. Biol. Works Fac. Sci. Osaka Univ. - 1965. - V.13. - P.107-110; Montal M., Mueller P. Proc. Nat. Acad. Sci. USA - 1972. - V.69. - P.3561-3566]. Однако оба эти метода имеют один значительный недостаток - наличие микролинз растворителя в центральной гидрофобной области мембраны и избытка раствора липида в окаймляющем мембрану мениске [White S.H., Petersen D.C., Simon S., Yafuso M. Biophys. J. - 1976. - V.16. - P.481-489; Chanturiya A.N. Биол. мембраны - 1996. - T.13. - C.216-221]. Присутствие растворителя в мениске приводит к неконтролируемому значению натяжения мембран, что затрудняет изучение ее механических параметров и может препятствовать встраиванию в них многих трансмембранных белков [Gennis R.B., Jonas A. Ann. Rev. Biophys. Bioen. - 1977. - V.6. - P.195-238]. Это послужило причиной поиска возможных путей минимизации количества растворителя в БЛМ. Так, существует целый ряд работ, в которых описаны различные модификации методик формирования мембран, подразумевающие использование высокомолекулярных растворителей, почти не образующих микролинз [White S.H. Biophys. J. - 1978. - V.23. - P.337-347], вымораживание растворителя из мениска [White S.H. Biochim. Biophys. Acta - 1974. - V.356. - P.8-17] или изменение экспериментальной системы [Vodyanoy V., Murphy R.B. Biochim. Biophys. Acta - 1982. - V.687. - P.189-194]. Однако каждая из этих модификаций вносит свои ограничения в применимость данной модельной системы и полностью не избавляет БЛМ от микролинз растворителя. Таким образом, получить удобную модель плоской липидной мембраны, не содержащей растворитель ни в мениске, ни в самом бислое, так и не удалось.

Известен способ [Takagi M., Azuma K., Kishimoto U. Annu. Rep. Biol. Works Fac. Sci. Osaka Univ. - 1965. - V.13. - P.107-110; Montal M., Mueller P. Proc. Nat. Acad. Sci. USA - 1972. - V.69. - P.3561-3566] (прототип) получения плоских БЛМ, осуществляющийся следующим образом. Две тефлоновые полуячейки, содержащие водный раствор электролита, разделены тефлоновой перегородкой с отверстием 0,1-1,0 мм в диаметре. На поверхность водного раствора в ячейках добавляют раствор липида в летучем органическом растворителе (пентан или гексан). После испарения растворителя уровни жидкости в полуячейках, первоначально находившиеся ниже отверстия, поочередно поднимают вверх. В результате алкильные цепи липидных молекул противоположных монослоев приходят в контакт на отверстии в перегородке, формируя липидный бислой.

Электрическая емкость таких БЛМ имеет величину не выше 0,7 мкФ/см², что является результатом присутствия неполярного растворителя в теле мембраны, а натяжение составляет 1-2 мН/м и определяется окружающим их мениском с растворителем.

Таким образом, недостатками прототипа являются низкое значение натяжения мембраны и невозможность получения БЛМ с фиксированным значением натяжения, нестабильность БЛМ из-за использования в качестве перегородки мягких полимерных пленок, что не позволяет проводить экспериментальные манипуляции с пленками. В результате всего этого исключается возможность получения мембран с наперед заданными свойствами, и, следовательно, затрудняется изучение ее механических параметров, исследование влияния на них молекулярной геометрии липидов, состава водных растворов, электрического поля и т.д., а также служит препятствием для встраивания в БЛМ многих трансмембранных белков.

Цель изобретения - получение БЛМ, обладающих высоким контролируемым значением натяжения, высокой электрической емкостью, стабильностью, а также упрощение способа получения БЛМ. Благодаря достижению этой цели облегчается изучение механических параметров БЛМ, встраивание в них трансмембранных белков, а следовательно, расширяются возможности использования мембран для решения целого ряда исследовательских задач и автоматизации процесса получения мембран.

Цель достигается тем, что в качестве основы для формирования БЛМ используют тонкую стеклянную пластинку с амфифобной поверхностью, что достигается путем фторсиликонизации стекла, т.е. обработкой его поверхности 3,3,3-трифторпропилтриметоксисиланом.

Неожиданность решения задачи получения БЛМ, не содержащих растворитель, обусловлена прежде всего выбором необычного материала для получения перегородок, на отверстиях в которых и формируются мембраны. Ранее для этих целей использовались только неполярные полимерные материалы, преимущественно тефлон. Его выбор обусловлен высокой химической стойкостью и гидрофобностью. Однако в присутствии амфифильных молекул липидов поверхность тефлона становится смачиваемой водой. Модифицировать поверхность полимеров для улучшения их свойств весьма проблематично. Оригинальным решением этой проблемы является использование стеклянных пластинок для создания перегородок. Стекло позволяет легко модифицировать свою поверхность, меняя гидрофобно-липофобные свойства в широком диапазоне путем создания химически привитого слоя различных молекул. Кроме того, стекло обладает высокой твердостью по сравнению с полимерами, что повышает стабильность получаемых мембран.

Второй важной оригинальной идеей, позволившей решить поставленную задачу получения мембран, не содержащих растворитель, является создание на поверхности стекол покрытий, обладающих не только гидрофобными, но и липофобными свойствами. Тем самым удалось препятствовать адсорбции на поверхности амфифильных молекул липидов, что позволило сохранить свойство несмачиваемости поверхности водой и в их присутствии, т.е. краевой угол смачивания оставался выше 90 градусов.

Согласно уравнению Юнга краевой угол капли θ определяется равновесием трех сил на границах раздела твердое тело-воздух (γ_тв-в), твердое тело-жидкость (γ_тв-ж) и жидкость-воздух (γ_ж-в):

Две первые из упомянутых сил направлены вдоль поверхности, а последняя - под наклоном по касательной к поверхности капли. Согласно приведенному уравнению в балансе всех трех сил γ_ж-в участвует в виде своей горизонтальной проекции. Изменение какой-либо из этих сил, т.е. межфазного натяжения на соответствующей границе, должно приводить к изменению краевого угла смачивания. При наличии на поверхности капли монослоя липида величина γ_ж-в будет соответствовать поверхностному натяжению липидного монослоя, а γ_тв-в и γ_тв-ж определяются адсорбцией молекул липида на гидрофобной поверхности. Амфифобизация поверхности приводит к значительному снижению адсорбции на ней различных веществ, в частности липидов, соответственно величины γ_тв-ж и γ_тв-в в присутствии липидов на такой поверхности не будут заметно меняться. Однако молекулы липидов, в силу своей амфифильной природы адсорбируясь на поверхности воды, неизбежно понижают ее поверхностное натяжение (величину γ_ж-в). В результате должен меняться баланс трех сил, определяющих краевой угол смачивания. Но если исходная его величина близка к 90°, сила γ_ж-в в области края капли направлена вертикально и при уменьшении никак не скажется на балансе сил, а соответственно и на самом краевом угле. Именно поэтому для формирования БЛМ, не содержащих растворитель, необходимо выполнение двух условий: 1) амфифобная поверхность, 2) краевой угол смачивания ее чистой водой не ниже 90°.

Способ осуществляется следующим образом: перегородки для формирования БЛМ изготовляют из покровных стекол толщиной около 100 мкм, в которых путем химического травления в плавиковой кислоте получают круглые отверстия диаметром 150-400 мкм. Для очистки и активации поверхности стекла применяется метод обработки плазмой водяных паров [Krishnamurthy V., Kamel I.H. J. Mater. Sci. - 1989. - V.24. - P.3345-3352]. Обработка покровных стекол плазмой водяных паров производится в течение 30-40 минут непосредственно перед дальнейшей химической модификацией (фторсиликонизацией).

Фторсиликонизация осуществляется путем обработки стекол 2% раствором (по объему) 3,3,3-трифторпропилтриметоксисилана в толуоле. После этого стеклянные образцы троекратно промываются толуолом для удаления остатков фторсилоксана, не связавшихся с поверхностью, и прогреваются в сушильном шкафу в течение 30 минут при температуре 120 градусов Цельсия. При такой обработке поверхность стекла приобретает амфифобные свойства, т.е. становится как гидрофобной, так и липофобной. В результате такой обработки краевые углы смачивания поверхности стекол как водой, так и октаном становятся близкими к 90°.

Бислойные липидные мембраны, не содержащие растворитель, формируют методом сведения двух монослоев [Takagi M., Azuma K., Kishimoto U. Annu. Rep. Biol. Works Fac. Sci. Osaka Univ. - 1965. - V.13. - P.107-110; Montal M., Mueller P. Proc. Nat. Acad. Sci. USA - 1972. - V.69. - P.3561-3566] в ячейке, разделенной на два отсека (полуячейки), амфифобизированным покровным стеклом с отверстием. Полуячейки наполняют 0,1 М раствором KCl в дважды дистиллированной воде так, чтобы уровень жидкости находился немного ниже отверстия в стеклянной перегородке. Для образования монослоя липида на поверхность воды в каждую полуячейку наносится необходимое количество раствора дифитаноилфосфатидилхолина (ДФФХ) в гексане концентрацией 1 г/л. Монослои сводят путем поочередного поднятия уровней жидкости в полуячейках выше отверстия через 15 мин после нанесения раствора липида. Это время необходимо для достижения полного испарения растворителя и растекания липида. При этом скорость поднятия уровня жидкости в полуячейках не должна превышать 0,1 мм/с. Подъем уровня во второй полуячейке останавливают около нижней кромки отверстия для спонтанного формирования БЛМ. Сформированная таким образом мембрана имеет удельную емкость 0,86 мкФ/см², что свидетельствует об отсутствии неполярного растворителя в теле мембраны. Полученная величина хорошо согласуется с рассчитанной емкостью плоского конденсатора, заполненного средой с диэлектрисеской проницаемостью, равной 2, и толщиной, соответствующей длине двух углеводородных радикалов использованного липида (ДФФХ), определяющих толщину неполярной области мембраны. Методом выдувания мембраны под действием перепада гидростатического давления было измерено натяжение полученной мембраны. Оно составило 4,3 мН/м, тогда как натяжение мембраны, полученной известным методом, составляет 1-2 мН/м.

Таким образом, получаемые предложенным нами способом БЛМ позволяют исследовать процесс слияния липидных бислоев без паразитного вклада, создаваемого микролинзами растворителя; отсутствие мениска с избытком липида в растворителе позволяет исследовать влияние молекулярной геометрии липидов, состава водного раствора, электрического поля и др. на механические параметры мембран; использование твердого неорганического материала для перегородок с отверстием повышают стабильность получаемых мембран по сравнению с мембранами на перегородках из мягких полимерных пленок (тефлон, полиэтилен и др.).

Предложенный способ формирования мембран прост, т.к. не требуется предварительная обработка кромок отверстия липидным раствором или высокомолекулярными углеводородами [Takagi M., Azuma K., Kishimoto U. Annu. Rep. Biol. Works Fac. Sci. Osaka Univ. - 1965. - V.13. - P.107-110; Montal M., Mueller P. Proc. Nat. Acad. Sci. USA - 1972. - V.69. - P.3561-3566], что делает возможным его автоматизацию для создания установок по скринингу биологически активных веществ и лекарственных препаратов.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения бислойных липидных мембран. Сущность способа заключается в том, что сводят два монослоя липида на отверстии в перегородке, разделяющей две полуячейки, наполненные водным раствором электролита, на поверхность которого нанесен слой липида в органическом растворителе. При этом в качестве перегородки используют покровное стекло, имеющее амфифобную поверхность, полученную путем обработки стекла 3,3,3,-трифторпропилтриметоксисиланом. Использование способа позволяет получить БЛМ с высоким контролируемым натяжением, высокой электрической емкостью, стабильностью, что является следствием отсутствия в мембране микролинз растворителя и отсутствия окружающего мембрану мениска с избытком липида в растворителе.

Способ получения бислойных липидных мембран (БЛМ), включающий обработку покровных стекол толщиной 100 мкм плавиковой кислотой и плазмой водяных паров до получения отверстий диаметром 150-400 мкм, обработку 2%-ным раствором (по объему) 3,3,3-трифторпропилтриметоксисилана в толуоле, прогревание в сушильном шкафу в течение 30 мин при температуре 120С°; далее формирование липидных мембран производят в ячейке, разделенной на два отсека амфифобизированным покровным стеклом с отверстием путем наполнения 0,1 М раствором KCl в дважды дистиллированной воде так, чтобы уровень жидкости находился немного ниже отверстия в стеклянной перегородке, нанесением на поверхность воды необходимого количества раствора дифитаноилфосфатидилхолина (ДФФХ) в гексане концентрацией 1 г/л в каждую полуячейку, сведение монослоев путем поочередного поднятия уровней жидкости в полуячейках выше отверстия через 15 мин после нанесения раствора липида, при этом скорость поднятия уровня жидкости в полуячейках не должна превышать 0,1 мм/с, подъем уровня во второй полуячейке останавливают около нижней кромки отверстия для спонтанного формирования БЛМ.