ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS MUCILAGINOSUS ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ УДОБРЕНИЯ И ЭКЗОПОЛИМЕРА Российский патент 1997 года по МПК C05F11/08 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/07 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности к получению бактериальных препаратов, применяемых в растениеводстве, и касается нового штамма для получения одного из бактериальных удобрений.

Известны штаммы Bac.mucilaginosus, отличающиеся по своим свойствам, например, штамм, имеющий способность преобразовывать кремнистые породы [1] или штамм 4[2] обладающий фосфатмобилизующей активностью из коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии.

Наиболее близким по своим свойствам оказался штамм 4 Недостатком этого штамма является очень невысокая продуктивность и нестабильная фосфатмобилизующая активность при выращивании на промышленнй питательной среде следующего состава, меласса 0,6; K₂HPO₄ 0,03; MgSO₄•7H₂O 0,1; NaCI 0,05; KNO₃ 0,1; мел 0,1.

Целью настоящего изобретения является получение штамма Bac.mucilaginosus, обладающего высокой активностью трансформировать нерастворимые и малорастворимые фосфаты в доступную для растений форму и синтезировать экзополисахариды.

Указанная цель достигнута тем, что методом селекции природных изолят, выделенных из окультуренных почв Куйбышевской области, был получен новый штамм, обладающий стабильной способностью трансформировать нерастворимые и малорастворимые (органические и минеральные) соединения фосфора и стабильной способностью синтезировать экзополисахариды.

Коллекционный номер Bac.mucilaginosus, штZ-B2-5987 во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов.

Культурально-морфологические признаки.

1. При выращивании на агаризованной питательной среде Эшби, имеющей состав,
сахароза 2
K₂HPO₄ 0,02
MgSO₄•7H₂O 0,02
NaCI 0,02
NH₄NO₃ 0,02
CaCO₃ 0,5
K₂SO₄ 0,0
Агар-агар 20 г/л,
при температуре 28±1^oC в течение 72 ч: круглые, правильные формы, выпуклые, бесцветные, прозрачные, слизистые колонии. При микроскопировании ("раздавленная капля") крупные палочки, палочки со спорами; при выращивании более 72 ч единичные палочки, преимущественно - палочки со спорами, споры.

2. При выращивание на безазотистой жидкой питательной среде Александрова N 27, имеющей составы,
Сахароза 0,5
Толченое стекло с 1% мела 0,1
Na₂HPO₄ 0,2
MgSo₄•7H₂O 0,05
FeCI₃ 1-2 капли 1%-го р-ра на 100 мл среды,
при температуре ферментации 28±1^oC и режиме азрации 180-200 об/мин, при условии естественного изменения значения pH и выращивании в течение 48 ч. Микробное число на 48 часу ферментации 8-12 млн. мл^-1; при микроскопировании крупные палочки с капсулами, единично клетки со спорами; активность растворения трикальцийфосфата (по зонам осветления в мм) - 4-10 мм. Синтез экзополисахаридов 1,0 1,4 г/л.

3. При выращивание на среде N 1 с мелассой, имеющей состав,
Меласса 0,6
K₂HPO₄ 0,03
MgSO₄•7H₂O 0,1
NaCI 0,05
KNO₃ 0,1
Мел 0,1,
при температуре ферментации 28±111^oC и длительности ферментации 48 ч (режим аэрации-перемешивания V_возд. V_среды= 1 1, на 18-24 часу ферментации культура представляет собою вязкую жидкость; при микроскопировании бактериальные клетки крупные палочки, единичные палочки, споры до 200-250 млн/мл; активность растворения трикальцийфосфата (по зонам осветления на чашках Петри) 3-8 мм; содержание экзополисахарида 1,2 1,6 г/л.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб, оптимальная температура роста плюс 28±1^oC, оптимальное значение pH 6,8-7,0; при глубинной ферментации на жидкой питательной среде оптимальный режим аэрации перемешивания 1:1, что соответствует сульфитному числу 1.

Отношение к углеводам и органическим кислотам.

Полностью усваивает глюкозу, сахарозу, лактозу, крахмал; плохо усваивает целлюлозу; не усваивает янтарную, молочную, лимонную, уксусную кислоты.

Отношение к источникам азота.

В качестве источника азота могут служить аммоний, нитраты, аминокислоты, мочевина. Максимальная продуктивность штамма обнаруживается при использовании сахарозы и аммония, минимальная при использовании глюкозы и нитрита натрия.

Отношение к нерастворимым соединениям фосфора.

Штамм обладает способностью растворять трикальцийфосфат, фторапатит, нуклеонат натрия.

Для поддержания штамма "Z" его выращивают на скошенной агаризованной среде состава,
Крахмал 1,0
K₂HPO₄ 0,03
NaCI 0,1
KNO₃ 0,1
Агар-агар 2,0
Температура выращивания 28±1^oC, продолжительность выращивания 72-78 ч. Хранение в пробирках на скошенной агаризованной среде при температуре плюс 6±2^oC до 2 лет (табл. 1).

Характерными особенностями штамма "Z" являются:
высокая продуктивность,
фосфатмобилизующая активность,
высокий уровень синтеза экзополисахаридов.

Примеры использования настоящего изобретения.

Пример 1. Получение бактериального препарата с использованием шт."Z".

Шт "Z" выращивали на жидкой питательной среде, включающей, мелассу 0,6, K₂HPO₄ 0,03, MgSO₄•7H₂O 0,1, KNO₃ 0,1, мел 0,1. Температура ферментации 28±1^oC, продолжительность ферментации 48 ч, при режиме аэрации-перемешивания V_{воздуха}: V_{пит.среды}= 1: 1 получили жидкую культуру, содержащую 300 млн/мл спор, содержание экзополисахаридов 0,2 г/л. Выращенную культуру смешивали с наполнителем, в качестве которого был использован бентонит. Полученную массу высушили на распылительной сушилке при мягком режиме: t^o _вх.=120^oC, t^oвых. 65^oC. Выход препарата по балансу жизнеспособных спор 95%
Препарат передан для предпосевной обработки семян моркови (I вар.) и в опытах по рекультивации отвалов Полтавского ГОК (II вар).

В I варианте применения прибавка урожая составляла по сравнению с контролем 23,8%
Во II варианте препарат вносили в сосуд с образцом отвала из расчета 90 мг препарата на 1 кг отвала; контроль образец отвала без внесения препарата. В каждый сосуд высевали семена донника белого. Изменение содержания фосфора ( в перерасчете на P₂O₅) приведены в табл.2.

Содержание фосфора в биоте повысилось уже через 2 месяца, а через 3 месяца в период цветения донника достигло 3,68 мг/кг, т.е. почти в 6 раз за месяц, или по сравнению с контролем более чем в 50 раз, что свидетельствует об активном растворений фосфора под действием внесенного препарата.

Пример 2. Препарат, полученный как в примере 1, применяли для обработки растений томатов в пленочной теплице при выращивании их на обычном тепличном грунте; содержание питательных веществ поддерживалось на оптимальном уровне. Препарат вносили в грунт перед высадкой рассады. Влияние препарата на урожай томатов (гибрид, сорт" Ласточка") приводится в табл.3.

Пример 3. Жидкую культуру Bac. mucilaginosus шт."Z", полученную на 48 часу, выращивания на среде N 1, применяли для обработки черенков плодовых и декоративных культур при высадке их в ящики и сравнивали укореняемость черенков в варианте с применением препарата и в контроле (т.е. без применения препарата). Влияние обработки (внесения в грунт) культуральной жидкостью штамма "Z" приводится в табл.4.

Применение жидкой культуры шт."Z" повышает число укоренившихся черенков по сравнению с контролем, а именно: черенков вишни на 14% черенков чубушника на 40% В случае высадки черенков лимонника укоренение черенков наблюдалось только при применении шт "Z".

Пример 4. Жидкую культуру Bac.mucilaginosus, шт. "Z", выращенную на среде с сахарозой, осаждали этиловым спиртом в соотношении 1:1; полученный осадок высушивали при 60^oC до постоянного веса. С 150,0 мл жидкой культуры получено 1,2 г экзополисахарида, т.е. выход составил 0,8% Аналитические исследования полисахарида обнаружили содержание в нем галактозы и маннозы.

Таким образом, установлено, что шт."Z" является перспективным не только для получения бактериального "почвоудобрительного" биопрепарата, но и для получения экзополисахарида.

Использованная литература:
1. Микробиологический журнал, 1989, т.51, N 5, с. 13-19.

2. Паспорт штамма бактерий Bac.mucilaginosus, шт.4 (музей культур микроорганизмов ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии), 1983 г.

Использование: сельскохозяйственная микробиология и биотехнология, в частности получение бактериальных удобрений, а также экзополимера (биополимера). Сущность изобретения: штамм бактерий Bacillus mucilaginosus выделен из окультуренной почвы, депонирован коллекции промышленных микроорганизмов под N B-5987. Штамм культивируют на жидкой питательной среде, содержащей источник углерода и минеральные соли при температуре 28±1^oC в течение 48 ч при аэрации. Выращенную культуру, содержащую 300 млн./мл спор и 0,2 г/л экзополисахаридов смешивают с бетоном и высушивают. Полученный препарат используют для предпосевной обработки семян растений, вегетирующих растений, черенков плодовых и декоративных культур, а также вносят в почву. 4 табл.

Штамм бактерий Bacillus mucilaginosus ВКПМ В-5987 для получения бактериального удобрения и экзополимера.