СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ФРАКЦИЙ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ КЛЕТОЧНЫХ БИОПОЛИМЕРОВ Российский патент 2002 года по МПК C12P1/00 

Изобретение относится к микробиологии, биохимии, биотехнологии и фармакологии, а именно к способам проведения ферментативного гидролиза биополимеров клетки с получением продуктов белковой, нуклеотидной, липидной и углеводной природы и может быть использовано в пищевой, медицинской, химической и микробиологической промышленности и других отраслях.

Одним из основных способов получения низкомолекулярных продуктов белковой, нуклеотидной, липидной и углеводной природы является ферментативный гидролиз клеточных биополимеров соответствующими гидролитическими ферментами [1, 2, 3].

Основным недостатком ферментативного гидролиза является его длительность и необходимость поддержания асептических условий.

Скорость ферментативного катализа и выход конечного продукта в гидролитических реакциях может зависеть как от увеличения активности ферментов, так и от изменения структурной организации субстрата, что определяющим образом влияет на фермент-субстратные взаимодействия. Известны способы увеличения активности ферментов путем введения в реакционную среду катионов поливалентных металлов. При этом катион металла может изменять конформацию как фермента, так и субстрата. Например, активность сериновой протеазы увеличивается при добавлении ионов Cа²⁺, поскольку ион кальция изменяет пространственную организацию данного фермента. При введении ионов Mg²⁺ в инкубационную смесь РНК и РНК-полимеразы скорость ферментативной реакции увеличивается, поскольку магний изменяет конформацию субстрата (РНК), что увеличивает ее сродство к ферменту.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому методу является способ обработки клеток Kluyveromyces fragilis в присутствии активирующей добавки, в качестве которой используется 0.1-8.2% раствор цетилтриметиламмонийбромида в фосфатном буфере при 4^oС в течение 30 мин. Внесение в реакционную среду вышеуказанной активирующей добавки приводит к увеличению активности внутриклеточного фермента β-галактозидазы на 20-30%, что вызывает соответствующее увеличение выхода, продуктов гидролиза [4].

Недостатком данного способа является то, что цетилтриметиламмонийбромид способен увеличивать выход продуктов гидролиза только при воздействии только на β-галактозидазу и не оказывает влияния на другие группы гидролитических ферментов, причем увеличение выхода продуктов происходит не более, чем в 1.3 раза.

Задачей настоящего изобретения является увеличение выхода низкомолекулярных фракций биологически активных веществ при ферментативном гидролизе биополимеров клетки и (или) сокращение времени процесса.

Поставленная задача решается тем, что в реакционную среду, содержащую субстрат и фермент, добавляют водорастворимую форму химического аналога фактора d-4-метилтирозол, взятого в количестве 5-1.5 г/л. Это приводит к увеличению выхода продуктов гидролиза биоподимеров в 1.5-2.0 раза и (или) сокращению времени процесса в 1.5 раза.

Применение способа проиллюстрировано ниже на следующих примерах.

Пример 1. Для приготовления опытной суспензии дрожжей Kluyveromyces fragilis в 100 мл дистиллированной воды суспендируют 14 г сухой биомассы, охлаждают до 4^oС, добавляют цетилтриметиламмонийбромид в концентрации 2 г/л.

Контрольную суспензию готовят так же, но не добавляют цетилтриметиламмонийбромид.

Контрольную и опытную суспензии выдерживают при 4^oС в течение 2 ч. Реакцию останавливают путем добавления в реакционную смесь 2 н. раствора гидроксида натрия. Далее разделяют жидкую и твердую фракции центрифугированием при 6000 об./мин в течение 10 мин. В жидкой фракции определяют концентрацию углеводов по реакции с фенолом [5]. Степень гидролиза оценивают как отношение концентрации углеводов в жидкой фазе к общему содержанию углеводов в исходном материале.

Степень гидролиза в контрольной суспензии составила 20%, а в опытной - 26%, т.е. выход продуктов гидролиза увеличился в 1.3 раза.

Пример 2. Для приготовления опытного раствора в 100 мл дистиллированной воды растворяют 10 г яичного альбумина. Раствор нагревают до 60^oС, устанавливают значение рН среды в интервале 7.2 -7.6. В прогретый раствор вносят 0.20 г протосубтилина Г3х и 0.15 г 4-метилтирозола.

Контрольный раствор готовят таким же образом, но не добавляют замещенный 4-метилтирозол.

Контрольный и опытный растворы выдерживают при 60^oС в течение 3 ч, после чего реакцию останавливают добавлением 50%-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ). В полученных гидролизатах оценивают содержание высоко- и низкомолекулярных белковых фракций по модифицированному методу Лоури [5]. Степень гидролиза белка оценивают как отношение концентрации низкомолекулярных белковых фракций к общему содержанию белка в растворе.

Степень гидролиаз белка в контрольном растворе составила 50%, в опытном - 80%, т.е. в присутствии химического аналога фактора d 4-метилтирозола выход продуктов гидролиза увеличивается в 1.6 раза.

Пример 3. Для приготовления опытного раствора в 100 мл дистиллированной воды растворяют 10 г яичного альбумина. Раствор нагревают до 55^oС, устанавливают значение рН среды в интервале 6.3 -6.6. В прогретый раствор вносят 3 г препарата поджелудочной железы крупного рогатого скота в виде 20%-ной суспензии в 1.5%-ном водном растворе этилового спирта и 0.15 г 4-метилтирозола.

Контрольный раствор готовят так же, как и опытный, за исключением добавления 4-метилтирозола.

Контрольный и опытный растворы выдерживают при 55^oС в течение 3 ч, после чего реакцию останавливают добавлением 50%-ной ТХУ, В полученных гидролизатах оценивают содержание аминного азота методом формольного титрования [5]. Степень гидролиза определяют как отношение концентрации аминного азота к содержанию общего азота в исходном растворе.

Степень гидролиза в исходном растворе составила 25%, в опытном растворе - 40%, т.е. выход продуктов гидролиза увеличился в 1.6 раза.

Пример 4. Для приготовления опытного раствора панкреатического гидролизата FHK, как субитанции, используемой в приготовлении фармацевтического препарата для лечения тапеторетинальных абитрофий [5], в 100 мл дистиллированной воды растворяют 15 г натриевой соли дрожжевой РНК. Раствор нагревают до 65^oС и устанавливают значение рН среды в интервале 5.0-5.5. В прогретый раствор вносят 60 мг лиофильно высушенной панкреатической РНК-азы с активностью 10000 ед./г и 0.15 г 4-метилтирозола.

Контрольный раствор готовят аналогичным образом, но без добавления 4-метилтирозола.

Контрольный раствор выдерживают при 65^oС в течение 3 ч, а опытный раствор - в течение 2 ч. Из полученных гидроливатов удаляют негидролизованную высокомолекулярную фракцию добавлением этилового спирта в количестве 20 мл. Выпавший осадок отделяют центрифугированием. Получают 110 мл раствора, который ультраконцентрируют на мембране УАМ-100 в 5 раз. В результате получают 86 мл пермеата, в который добавляют 880 мл этилового спирта (10-кратный объем) и осаждают панкреатический гидролизат РНК. Осадок отделяют центрифугированием и высушивают на воздухе.

Полученные панкреатические гидролизаты РНК в контрольном и опытном образцах имеют следующие показатели: содержание основного вещества - 75; соотношение длин волн А₂₆₀/А₂₃₀ - 1.60; соотношение длин волн A₂₆₀/A₂₈₀ - 3.15; выход продукта в расчете на массу натриевой соли дрожжевой РНК - 51%.

Как видно из приведенных данных, введение в реакционную среду 4-метилтирозола не вызывает ухудшения качества конечного продукта. Выход продукта не увеличивается, однако время гидролиза сокращается в 1,5 раза.

Пример 5. Для приготовления опытной суспензии в 100 мл дистиллированной воды суспендируют 14 г зерновых отходов пивоваренного производства, содержащих 75%. клетчатки. Суспензию нагревают до 55^oС, устанавливают значение рH среды равным 5.0, вносят 0.70 г целловиридина Г 10х активностью 2000 ед./г и 0.15 г 4-метилтирозола.

Контрольную суспензию готовят так же, но не добавляют 4-метилтирозол.

Контрольную и опытную суспензию выдерживают при 55^oС в течение 2 ч. Реакцию останавливают путем добавления в реакционную смесь 2 н. раствора гидроксида натрия. Далее разделяют жидкую и твердую фракции центрифугированием при 6000 об./мин в течение 10 мин. В жидкой фракции определяют концентрацию углеводов по реакции с фенолом [5]. Степень гидролиза оценивают как отношение концентрации углеводов в жидкой фазе к общему содержанию углеводов в исходном материале.

Степень гидролиза в контрольной суспензии составила 20%, а в опытной - 45%, т.е. выход продуктов гидролиза увеличился в 2.25 раза.

Пример 6. Для приготовления опытной суспензии в 100 мл дистиллированной воды суспендируют 10 г распылительно высушенной биомассы дрожжей р.Candida maltosa. Суспензию нагревают до 45^oС, устанавливают значение рН среды на уровне 7.5-8.0. В подготовленную суспензию вносят 0.2 г лиофильно высушенной липазы Г10х с активностью 2500 ед./г и 0.15 г 4-метилтирозола.

Контрольную суспензию готовят аналогичным образом за исключением добавления 4-метилтирозола.

Контрольную и опытную суспензию выдерживают при 45^oС в течение 2 ч. Реакцию останавливают путем добавления в реакционную смесь 1 мл соляной кислоты и помещения на 1 ч в морозильную камеру. Далее разделяют жидкую и твердую фракции центрифугириванием при 6000 об./мин в течение 10 мин. В твердой фракции определяют концентрацию липидов по методу Соколетта [5]. Степень гидролиза оценивают как отношение содержания липидов в жидкой фазе к общему содержанию липидов в исходном материале.

Степень гидролиза в контрольной пробе составила 40%, а в опытной - 70%, т.е. выход продуктов гидролиза увеличивается в 1.75 раза.

Таким образом, сравнение приведенных способов с прототипом показывает, что внесение в реакционную среду активирующей добавки в виде водорастворимой формы химического аналога фактора d-4-метилтирозола приводит к увеличению выхода низкомолекулярных фракций биологически активных веществ, получаемых ферментативным гидролизом клеточных биополимеров в 1.5-2.0 раза, или к сокращению времени процесса гидролиза в 1.5 раза.

ЛИТЕРАТУРА
1. Ф. Гаурович - Химия и функции белков. /Москва, издательство "Mир", 1965 г., 532 с.

2. Фукс Б. Шабанова М. Е., Федоров С.Н., Краснопольский Ю.М. и др. - Способ получения рибонуклеотидов. - А.с. 157359 - опубл. 01.03.90.

3. Введение в прикладную энзимологию /под ред. чл-корр. И.В. Березина и проф. К. Мартинек.

4. Joshi M. S. , Gowda L.R., Bhat S.G. Permeabilization of yeast cells (kluyveromyces fragilis) to lactose by cetyltrimethylammonium bromide. - biotechnol. Left, 1987, v.9, 8, p. 549-554.

5. Практикум по биохимии. /Под ред. Северина С.Е./ / М.:МГУ, 1989, 509 с.

Изобретение относится к способам проведения ферментативного гидролиза биополимеров клетки с получением продуктов белковой, нуклеотидной, липидной и углеводной природы. Может быть использовано в пищевой, медицинской, химической и микробиологической промышленности и других отраслях. Сущность изобретения: в реакционную среду, содержащую субстрат и фермент, добавляют водорастворимую форму химического аналога фактора d-4-метилтирозол, взятого в количестве 5-1,5 г/л. Способ обеспечивает увеличение выхода продуктов гидролиза биополимеров в 1,5-2,0 раза и (или) сокращение времени процесса в 1,5 раза.

Способ получения низкомолекулярных фракций биологически активных веществ ферментативным гидролизом клеточных биополимеров в присутствии активирующей добавки, отличающийся тем, что в качестве активирующей добавки используют водорастворимую форму химического аналога фактора d-4-метилтирозол, взятого в количестве 5-1,5 г/л.