СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ РИБОНУКЛЕАЗЫ Российский патент 2002 года по МПК C12N9/22 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения панкреатической рибонуклеазы, и может быть использовано в медицинской, химической и микробиологической промышленности.

Обычно рибонуклеазу выделяют из свежей бычьей поджелудочной железы. Для этого ткань поджелудочной железы экстрагируют 0,25 н серной кислотой, охлажденной на льду. Затем добавляют сернокислый аммоний до 0,6 насыщения, переводя в осадок трипсиноген, химотрипсиноген и дезоксирибонуклеазу. Рибонуклеазу осаждают из фильтрата, повышая концентрацию сернокислого аммония до 0,8 насыщения. Путем фракционного осаждения сернокислым аммонием можно получить рибонуклеазу в чистом виде. Однако полученный таким способом фермент бывает загрязнен следовыми количествами протеолитических ферментов [1].

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения панкреатической РНК-азы [2] , предполагающий проведение следующих основных стадий.

1) Измельчение сырой поджелудочной железы (получение гомогената).

2) Экстракция РНК-азы из гомогената поджелудочной железы 0,25 н раствором серной кислоты (объемное соотношение поджелудочная железа: серная кислота 1:2) при температуре 4-6^oС в течение 24 часов.

3) Отделение осадка взвешенных частиц центрифугированием или фильтрованием.

4) Отделение балластных белков высаливанием в среде 60%-ного раствора сульфата аммония.

5) Осаждение РНК-азы высаливанием в среде 85%-ного раствора сульфата аммония.

6) Очистка технической РНК-азы переосаждением из 85%-ного раствора сульфата аммония.

7) Обезвоживание осадка РНК-азы этанолом.

8) Сушка кристаллов РНК-азы под вакуумом при температуре 50^oС.

Выход препарата по предлагаемой технологии составляет 0,1% от массы сухой поджелудочной железы.

Недостатком данного способа получения панкреатической РНК-азы является низкий выход продукта из-за многостадийности процесса, низкая степень осаждения РНК-азы вследствие ее малой концентрации в растворе.

Задачей настоящего изобретения является увеличение выхода панкреатической РНК-азы.

Поставленная задача решается тем, что предлагается способ получения панкреатической РНК-азы, включающий стадии измельчения, экстракции РНК-азы, отделение взвешенных частиц центрифугированием, осаждение рибонуклеазы, очистку от примесей, промывку этиловым спиртом, в котором после отделения взвешенных частиц центрифугированием или фильтрованием проводят ультраконцентрирование экстракта на мембране УПМ-450 с возвратом кислого пермеата на стадию экстракции, осаждение проводят в изоэлектрической точке с последующей термоинактивацией белков, обладающих протеазной и ДНК-азной активностью.

Применение способа проиллюстрировано ниже на примерах.

Пример 1 (по прототипу)
1000 г (200 г по абсолютно сухому веществу) предварительно измельченной поджелудочной железы заливают 2000 мл 0,25 н раствора серной кислоты, выдерживают при перемешивании и температуре 4-6^oС в течение 24 часов. Взвешенные частицы отделяют центрифугированием или фильтрованием, в результате получают 2300 мл супернатанта с активностью РНК-азы 250 ед./мл. К супернатанту добавляют 1500 г сульфата аммония. Суспензию охлаждают до 4-6^oС, выдерживают 6 часов, после чего отделяют осадок балластных белков центрифугированием. Получают 2000 мл фильтрата. К фильтрату добавляют еще 400 г сульфата аммония, охлаждают до 4-6^oС и выдерживают при этой температуре в течение 2 суток при периодическом перемешивании. Осадок технической рибонуклеазы отделяют фильтрованием. Получают 0,9 г кристаллов. Влажные кристаллы растворяют в 10 мл дистиллированной воды и добавляют 8 г сульфата аммония. Суспензию выдерживают на холоду (4-6^oС) в течение 8-10 часов, после чего кристаллы рибонуклеазы отделяют фильтрованием, получают 0,7 г влажных кристаллов. Их промывают на фильтре 7 мл этанола и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. В результате получают 0,2 г рибонуклеазы с активностью 12000-14000 ед./мг. Выход продукта составляет 0,1% от массы сухой поджелудочной железы.

Пример 2
1000 г (200 г по абсолютно сухому веществу) предварительно измельченной поджелудочной железы заливают 2000 мл 0,25 н раствора серной кислоты, выдерживают при перемешивании и температуре 4-6^oС в течение 24 часов. Взвешенные частицы отделяют центрифугированием, в результате получают 2300 мл супернатанта с активностью РНК-азы 250 ед./мл. Супернатант подвергают ультраконцентрированию через ацетилцеллюлозную мембрану УПМ-450 с диаметром пор 450 А при давлении 0,2 МПа. Получают 230 мл ультраконцентрата с активностью РНК-азы 3200 ед./мл. Пермеат объемом 2070 мл повторно используют на стадии экстракции, ультраконцентрат охлаждают до температуры 4-6^oС и добавляют 25%-ный водный раствор аммиака до достижения значения рН среды 7,8-8,0. Суспензию РНК-азы выдерживают 6-8 часов при температуре 4-6^oС, после чего кристаллы технической РНК-азы отделяют фильтрованием. Получают 4,5 г влажных кристаллов. Осадок РНК-азы растворяют в 60 мл дистиллированной воды. Раствор нагревают до температуры 85-90^oС и выдерживают 10 мин. После этого раствор охлаждают до температуры 4-6^oС, добавляют 25%-ный водный раствор аммиака до достижения значения pH среды 7,8-8,0 и выдерживают при температуре 4-6^oС в течение 6 часов. Выпавшие кристаллы очищенной РНК-азы массой 4 г отделяют фильтрованием, промывают 40 мл этанола и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. В результате получают 1,2 г рибонуклеазы с активностью 12000-14000 ед./мг.

Таким образом, сравнение предлагаемого способа и прототипа показывает, что введение в технологическую схему стадии ультрафильтрации и замена осаждения высаливанием на осаждение в изоэлектрической точке позволяет увеличить выход панкреатической рибонуклеазы в 6 раз за счет увеличения начальной концентрации РНК-азы в растворе на стадии осаждения, а также за счет повторного использования кислого раствора (пермеата) на стадии экстракции.

ЛИТЕРАТУРА
1. Kunitz M., J. Gen. Physiol, 24, 15 (1940).

2. McDonald M.R., Methods in enzymology, Vol. 2, p. 427, (S.P.Colowick and N.O. Kaplan, Eds.), New York. Academic Press (1955).

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения панкреатической рибонуклеазы, и может быть использовано в медицинской, химической и микробиологической промышленности. Способ получения панкреатической РНК-азы включает стадии измельчения, экстракции РНК-азы, отделение взвешенных частиц центрифугированием, осаждение рибонуклеазы, очистку от примесей, промывку этиловым спиртом, сушку. После отделения взвешенных частиц центрифугированием или фильтрованием проводят ультраконцентрирование экстракта на мембране УПМ-450 с возвратом кислого пермеата на стадию экстракции. Осаждение проводят в изоэлектрической точке с последующей термоинактивацией белков, обладающих протеазной и ДНК-азной активностью. Способ обеспечивает увеличение выхода препарата с 0,1 до 0,6% от массы сухой поджелудочной железы, т.е. в 6 раз.

Способ получения панкреатической РНК-азы, включающий стадии измельчения, экстракции РНК-азы, отделение взвешенных частиц центрифугированием, осаждение рибонуклеазы, очистку от примесей, промывку этиловым спиртом, сушку, отличающийся тем, что после отделения взвешенных частиц центрифугированием или фильтрованием проводят ультраконцентрирование экстракта на мембране УПМ-450 с возвратом кислого пермеата на стадию экстракции, а осаждение проводят в изоэлектрической точке с последующей термоинактивацией белков, обладающих протеазной и ДНК-азной активностью.