СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ КОНТРОЛЬНЫХ ПАНЕЛЕЙ СЫВОРОТОК ДЛЯ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ДИАГНОСТИКИ ГЕПАТИТА В Российский патент 2002 года по МПК G01N33/96 G01N33/53 

Изобретение относится к области иммунологии и стандартизации и может быть использовано в технологии изготовления панелей сывороток, содержащих антигены наиболее опасных вирусных инфекций, и в организации внешнего контроля лабораторных исследований.

Внешний контроль качества лабораторных исследований является неотъемлемой частью обеспечения информативности и достоверности лабораторной диагностики [l]. Серологическая диагностика HBsAg - основной инструмент контроля и профилактики гепатита В.

Для этой цели наиболее широко используется при скриннинге иммуноферментный метод анализа - ИФА. Для выполнения ИФА используют тест-системы, представляющие собой многокомпонентные наборы ингредиентов. На эффективность проведения иммуноферментного анализа влияет не только качество этих ингредиентов, но и профессиональная подготовленность лабораторного персонала, обеспечивающего проведение теста [2]. Для обеспечения объективной внешней оценки качества лабораторного исследования крайне необходимы специально приготовленные и аттестованные контрольные материалы.

Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биопрепаратов проводит подготовку контрольных материалов и внешнюю оценку качества лабораторных исследований на антитела к ВИЧ с 1988 г. На Совещании экспертов ВОЗ в 1996 г. особое внимание было обращено на аттестацию национальных стандартов, используемых для контроля тест-систем и контроля качества анализов на выявление маркеров ВИЧ, гепатитов С и В. Совет экспертов рекомендовал аттестацию национальных стандартов иммунобиологических препаратов и препаратов на основе сыворотки человека выполнять в относительных единицах (ME), но не в абсолютных (нг), т.к. процедуры концентрирования и выделения искомых белков могут неконтролируемым образом изменять их специфические свойства [3].

При осуществлении программы внешнего контроля качества (ПВКК) следует иметь в виду, что лабораторные исследования образцов сывороток на присутствие HBsAg выполняются с помощью тест-систем разных фирм. Спектр выявляемых субтипов и предельная чувствительность анализа являются основной критериальной величиной для оценивания качества диагностики гепатита В в серологических лабораториях клиник и станций переливания крови.

Используемые в лабораториях тест-системы имеют различное строение и разные режимы выполнения анализов. Одни тест-системы построены на 2-3 моноклональных антителах (MAT), в состав других включены дополнительно поликлональные антитела (ПАТ). Известно, что введение ПAT элиминирует "hook-effect" и расширяет спектр выявляемых субтипов HBsAg [4,5]. Основное достоинство наборов, построенных на MAT, заключается в высокой специфичности. К сожалению, моноклональные тест-системы, зачастую, не способны выявлять все субтипы HBsAg. Они обладают значительно более высокой чувствительностью к "своему субтипу", чем тест-системы с участием ПАТ, но могут абсолютно не выявлять "чужой субтип".

Кроме того, в общем случае величина оптической плотности для растворов контрольных материалов различна для разных разводящих растворов. В связи с этими и подобными проблемами совет экспертов ВОЗ рекомендует вместо описания концентрации HBsAg в нг/мл использовать классический способ для биохимических компонентов в международных единицах (ME).

Для установления взаимосвязи между ME и нг/мл используют:
- препарат HBsAg - плазменный очищенный, содержание искомого белка >95%;
- контрольные образцы сер. 2 и 4 теста "Lаbsystems", аттестованные относительно стандартного образца (СО) института П. Ерлиха, aу - субтипа, приблизительно 1 МЕ/мл.

Титрование аттестованных препаратов проводят в тест-системах "Рекоматген В" и "Labsyatems". В результате проведенных испытаний установлено, что для тест-системы "Рекоматген В" эквивалент равен 1 U/ml = 4,1±0,3 нг/мл и для тест-системы "Labsystems" эквивалент равен 1 U/ml = 5,2±0,2 нг/мл.

Решение проблемы создания контрольной панели сывороток крови человека на содержание HBsАg предлагается осуществить следующим способом:
- использовать для создания контрольной панели нативные сыворотки пациентов с диагнозом гепатит В, принадлежащие к различным субтипам, с аттестованной в международных единицах концентрацией НВsAg;
- в качестве разводящего раствора использовать пул сывороток здоровых доноров, которые не содержат маркеров основных инфекций;
- в качестве стабилизатора использовать известный материал [6].

Известны панели сывороток Boston Biomedical Inc. (США): Hepatitis В Surface Antigen Sensitivity Pаnel (PHA 806) [7]. Панель включает образцы сывороток, аттестованных одновременно по концентрации HBsAg в абсолютных - от 2,5 нг/мл до 0,1 нг/мл и в относительных единицах от 0,31 до 0,01 МЕ/мл и одну отрицательную сыворотку.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ, разработанный в Центральной лаборатории (стандартов голландского Красного Креста для приготовления контрольных панелей марки Pelichek [8]. Эти панели представляют собой 8-10 разведенных образцов стандартного препарата HBsAg в пуле донорских сывороток, не содержащих маркеров опасных вирусных инфекций.

Способ-прототип включает приготовление стандартной сыворотки из пула реактивных нативных сывороток, содержащих HBsAg и имеющих разную концентрацию этого белка. Основными этапами изготовления стандартной сыворотки являются:
- сбор реактивных сывороток для приготовления стандарта HBsAg;
- сбор донорских сывороток, не содержащих антиHBs антитола и маркеров основных вирусных инфекций;
- изготовление разводящей сыворотки, не содержащей фибриногена и липидов, из пула отобранных донорских сывороток;
- разведение стандарта HBsAg в разводящей сыворотке в 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 1024, 2048 и 8192 раз.

К достоинствам способа-прототипа следует отнести разработку общей схемы приготовления стандарта НBsAg и приготовления разводящей сыворотки, которая может быть реализована при изготовлении сывороток для контрольных панелей с HBsAg и другими маркерами (антиВИЧ и антиВГС).

Основные недостатки прототипа:
- разводящая сыворотка является идеализированной (т.е. из сыворотки удален фибрин, фибриноген и липиды) моделью нативной сыворотки крови человека;
- панель "Pelicheck" приготовлена на одном пуле сывороток, не аттестована количественная концентрация HBsAg, a использован только метод кратного разведения. Для другого пула сывороток этим же разведениям будут отвечать другие концентрации HBsAg;
- в панели не представлены отрицательные сыворотки;
- сыворотки панели-прототипа не стабилизированы и не лиофилизированы.

Задачей настоящего изобретения является создание такого способа, который обеспечивает изготовление контрольной панели из нативных сывороток, содержащих HBsAg разных субтипов с нормированными концентрациями НBsAg в международных единицах, для оценки качества выполнения анализа HBsAg и позволяет сохранить специфические характеристики сывороток панели в течение длительного времени (около 2-х лет).

Поставленная задача решается тем, что в способе получения панелей сывороток для контроля качества лабораторных анализов на гепатит В, включающем отбор донорских сывороток, не содержащих специфические антитела к основным маркерам вирусных инфекций, приготовление разводящего раствора из пула отобранных сывороток, отбор реактивных нативных сывороток НBsAg и разведение их в разводящем растворе, проведение теста термодеградации для установления сроков годности контрольной панели, согласно изобретению отбор разводящих сывороток для панелей проводится по схеме, включающей их аттестацию методами ИФА и ПЦР на наличие НBsAg и ДНК вируса гепатита В (ВГВ) и титрование образцов HBsAg, причем отрицательные сыворотки панели формируют из нативных сывороток с нулевым титром, которые имеют отрицательный результат в ПЦР ДИК ВГВ, а в ИФА - величину ОП меньше критической (в диапазоне 0,6-0,9 OП крит. ). Положительные сыворотки панели формируют из нативных сывороток пациентов с диагнозом гепатит В, содержащих различные субтипы НВsАg и разведенных до концентрации HBsAg от 1,0 до 0,1 МЕ/мл в разводящем растворе, содержащем известный стабилизатор. Приготовленные сыворотки лиофильно высушивают до остаточной влажности не более 1,5 мас.%.

Отбор донорских сывороток проводят в 2 этапа:
1) отбор сывороток, не содержащих антитела к ВИЧ, вирусам гепатита В и С, сифилису, имеющих ОП≤0,5 OП крит.;
2) отбор сывороток доноров, имеющих оптическую плотность от 0,6 до 0,9 ОП крит.

Донорские сыворотки, отобранные после проведения 2-х этапов, контролируют методом ПЦР на отсутствие ДНК ВГВ. Из донорских сывороток, имеющих значение ОП в HBsAg ИФА меньше, чем 0,5 ОП крит., приготавливают пул. В пул вносят стабилизатор в сухой форме, компоненты которого не оказывают подавляющего эффекта на аналитический сигнал HBsAg в ИФА. Для предотвращения бактериального пророста в пул вносят бактерицидные компоненты. Подготовленный таким способом пул донорских сывороток используют в качестве разводящего раствора для разведения реактивных нативных образцов до требуемой концентрации HBsAg в диапазоне от 1 МЕ/мл до 0,1 МЕ/мл.

Основные этапы приготовления положительных образцов контрольной панели следующие.

Сыворотки, реактивные на HBsAg, отбирают по результатам скриннинга сывороток крови пациентов с диагнозом гепатит В с использованием тест-систем, аттестованных в приказе МЗ РФ по 1-ому списку.

Для установления связи между аналитическим сигналом ИФА и количеством HBsAg необходимо использовать ИФА тест-системы, которые в диапазоне от 1,5 до 0,1 MЕ/мл показывают прямолинейную связь между оптической плотностью и концентрацией HBsAg в разводящем растворе.

Донорские отрицательные сыворотки, имеющие ОП в ИФА от 0,6 до 0,9 ОП крит., используют в нативной форме в качестве отрицательных образцов панели. Сыворотки стабилизируют и вводят мертиолят 0,015%.

Образцы приготовленных стабилизованных сывороток контрольной панели с нормированным содержанием HBsAg анализируют в высокочувствительных тест-системах различного формата (одно- и двустадийные, ускоренные и с ночной инкубацией) отечественного и европейского производства. При отличии полученных концентраций HBsAg от заданных содержание их корректируют в сторону увеличения путем введения аликвоты реактивной сыворотки или в сторону уменьшения о помощью разводящего раствора. Жидкие образцы лиофилизируют по режиму, специально разработанному для данного вида препаратов и состава стабилизатора по способу, изложенному в [9].

Применимость созданных по настоящему изобретению препаратов-сывороток с нормированным уровнем HBsAg проверяется рассылкой панелей в различные лаборатории и контрольные службы предприятий-производителей тест-систем в соответствии с программой аттестации диагностических лабораторий, разработанной отделом внешнего контроля качества МЗ РФ [1].

Таким образом, процедура аттестации сывороток контрольной панели включает три этапа, результаты которых независимы и позволяют надежно идентифицировать количество НВsAg.

Установленная при этой аттестации концентрация HBsAg вносится в паспорт на контрольную панель данной серии. Срок службы созданных по настоящему изобретению контрольных препаратов устанавливают по результатам теста термодеградации при температурах 4^oС и 37^oС в соответствии с [9].

Для проведения внешней оценки качества лабораторных исследований на НВsАg в диагностические лаборатории клиник и станций переливания крови передаются контрольные панели с зашифрованными образцами. Таким образом, все лаборатории получают идентичные и аттестованные контрольные материалы.

Для исключения влияния на результаты постановки каждой сыворотки возможных различий в реактивности антигена в разных лунках иммуносорбента каждый зашифрованный образец панели анализируется при выполнении исследования на менее чем в 4-6 повторах.

Новым по сравнению с прототипом является:
- применение в качестве образцов контрольной панели нативных сывороток крови человека;
- использование в качестве положительных образцов панели реактивных сывороток, содержащих различные субтипы НВsAg;
- приготовление сывороток с концентрацией HBsAg в диапазоне от 1 МЕ/мл до 0,1 МЕ/мл.

- изготовление контрольной панели в сухой стабилизированной форме.

Предложенный способ получения панели сывороток для контроля качества выполнения анализов сывороток (плазмы) крови человека и вакцин на гепатит В в литературе не описан, следовательно, можно сделать вывод о соответствии технического решения критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

На фиг. 1 изображены кривые титрования HBsAg реактивных сывороток в разводящем растворе.

Примеры выполнения способа.

Пример 1.

Приготовление контрольной панели HBsAg.

Донорские К-сыворотки получают с СПК, аттестованными на отсутствие антиВИЧ, антиВГС, НВsАg и антител к сифилису. В лаборатории сыворотки дополнительно контролируют наличие антиHBs и антиПВс антител в отрицательных сыворотках. Отобранные на 1-м этапе К-сыворотки (плазму) фильтруют и центрифугируют. Для отделения сывороток (плазмы) от хлопьев и сгустков собирают фильтрационную установку из колбы и воронки. В качестве фильтрующего элемента используют 3 слоя марли, между которыми проложен слой ваты. Затем донорские К-сыворотки (плазма) центрифугируют со скоростью 1 200 об./мин в течение 10 мин. Осадок отбрасывают. Осветленные донорские сыворотки анализируют в тест-системах "Рекоматген В" (ЗАО Майстар) и "Вектоген В 1,2" (ЗАО "ВекторБест"). Сыворотки с ОП<0,5 ОП крит. используют для приготовления рабочего раствора, а донорские сыворотки с ОП >0,6 ОП крит. используют для приготовления отрицательных образцов контрольной панели.

Реактивные на HBsAg сыворотки в количестве 8 образцов получают от больных с диагнозом гепатит В и с показателем ОП в ИФА более 2,0 о.е. Эти реактивные сыворотки анализируют на панели моноклональных антител для определения субтипа HBsAg. Все сыворотки данной серии контрольной панели оказались принадлежащими к ayw l-2, ayw 3, var A и ayw 3, var B субтипам.

На 2-м этапе готовят разводящий раствор из донорских сывороток и стабилизатора.

Донорские сыворотки с ОП<0,5 ОП крит. смешивают в одной емкости на магнитной мешалке. Одновременно готовят стабилизатор на 1 л смешанной сыворотки, последовательно растворяя пептон, сахарозу, KC1 и ЭДТА в пуле донорских сывороток в следующих количествах: пептон (Serva) 25 г, сахароза 60 г, КСl 10, казеин 7 г.

Разводящий раствор доводят до рН 6,8-7,1 с помощью 0,1 М NaCl. В качестве бактерицидной добавки вводят мертиолят в количестве 0,01% от массы раствора. Раствор сывороток с внесенными компонентами стабилизатора фильтруют последовательно через фильтры 0,8 мкм и 0,45 мкм для осветления.

Реактивные сыворотки различных НBsAg субтипов титруют в разводящем растворе одновременно со стандартом фирмы "Labsystems", аттестованном относительно первичного стандарта института П. Ерлиха ау субтипа в количестве 1 МЕ/мл, на одном микропланшете в тест-системе "Рекоматген В" с шагом 3 (cм. чертеж). Совместная обработка кривых титрования реактивных сывороток-кандидатов и стандартного образца позволяет для данного разводящего раствора подобрать коэффициенты разведения для получения концентрации НBsAg в диапазоне от 1 МЕ/мл до 0,1 Ме/мл.

Положительную сыворотку контрольной панели каждого номера получают в процессе смешения сыворотки-кандидата с разводящим раствором в соотношении, заданном коэффициентом разведения. Разведение для каждого из 6-ти номеров ocyщecтвляют в емкости объемом 500 см³, установленной на магнитной мешалке в течение 10-15 мин. Определение ОП образцов контрольной панели всех номеров проводят в ИФА тест-системах того же типа, которые использовали при титровании первичных растворов.

Разведенные образцы, пригодные по результатам тестирования для приготовления контрольной панели, передают на операцию розлива. Для сывороток, оптическая плотность которых не соответствует требуемой концентрации HBsAg, проводят корректировку концентрации с использованием исходной сыворотки-кандидата или разводящего раствора. Таким способом готовят 6 образцов панели, имеющих различное содержание HBsАg: по 2 образца каждого субтипа в диапазоне от 1 до 0,1 МЕ/мл.

Отрицательные сыворотки референс-панели готовят из нативных донорских сывороток, не содержащих антиВИЧ, антиВГС и антитела к сифилису, а также HBsAg. С этой целью в них добавляют стабилизатор того же состава и в том же количестве, что и при приготовлении разводящего раствора. Всего готовят 4 образца, не содержащих HBsAg, но имеющих повышенные значения ОП в ИФА от 0,6 до 0,9 ОП крит.

Все 10 образцов сывороток панели контролируют на отсутствие ДНК ВГВ методом ПЦР в системе "ДНК ПЦР ВГВ" (ЗАО "Вектор Бест"). От каждого номера образца отбирают в пенфлаконы котрольные пробы для ИФА по 1,5-2,0 мл.

Сыворотки панели разливают в ламинарном шкафу по 0,8 мл во флаконы объемом 5 мл, закрывают резиновыми пробками и размещают в металлические кассеты для замораживания. Замораживание сывороток проводят при температуре минус(60±5)^oС, выдерживая их при этой температуре не менее 20 ч. Температура в процессе замораживания поддерживается автоматически и контролируется аппаратчиком.

Замороженный препарат во флаконах переносят в сублимационную камеру лиофильной установки TG-50, полки которой охлаждены до -35^oС. Температуру материала на стадии сублимационного обезвоживания поддерживают ниже температуры его стеклования (-35^oС). Средняя скорость нагревания материала на этапе досушивания составляет 4^oС/мин, время досушивания при 27^oС составляет 10 ч.

Лиофильно высушенные образцы контрольной панели имеют остаточное содержание воды около 1,0-1,5 мас.%. Определение проводят по методике. Флаконы с препаратом укупоривают под вакуумом. Вакуум в камере контролируют по вакуумметру. Общее среднее время сушки составляет 36 ч.

Контроль специфической активности лиофилизованных и исходных жидких сывороток с приготовленной концентрацией HBsAg проводят в тест-системах "Рекоматген В" и "Вектоген В2". По результатам предварительной аттестации были отброшены одна реактивная сыворотка и одна отрицательная. Таким образом, в составе контрольной панели остались 5 положительных образцов и 3 отрицательных. Результаты анализа приведены в табл. 1.

Термостабильность образцов контрольной панели оценивается по результатам теста термодеградации, проведенного при 37^oС в течение 3-х недель. Результаты ИФА представлены в табл. 2 в сравнении с результатами для сывороток панели, хранившихся в холодильнике при 4^oС.

На основании полученных результатов теста термодеградации можно оценить срок годности препаратов с аттестованной концентрацией HBsAg по стандартной методике [10] . Для хранения препаратов при температуре 4^oС срок годности t (4^o) оценивается:
t(4^oС)=3 нед.•24=72 нед.

Таким образом, полученная оценка срока годности сывороток HBsAg панели соответствует требованиям экспертов ВОЗ по стандартным биопрепаратам.

Экономическая эффективность применения предлагаемого способа изготовления образцов сывороток HBsAg контрольной панели заключается в том, что контрольная панель формируется из нативных сывороток с HBsAg различных субтипов. Такая панель значительно повышает результативность внешнего контроля качества лабораторных диагнозов гепатита В.

Использование такого подхода для маркеров других опасных инфекций значительно сократит расходы на их разработку и изготовление. Это относится, в первую очередь, к диагностике ВИЧ и гепатита С.

Кроме того, введение в практику серологии сывороток-калибраторов с известной концентрацией HBsAg и разных субтипов создает основу для контроля правильности анализов на количественное содержание этого маркера в крови и тем самым юридическую основу для разрешения конфликтов между производителями и пользователями HBsAg тест-систем.

Повышение качества анализов способствует более точной постановке правильного диагноза и снижению социальной напряженности в обществе.

Промышленная применимость
Изобретение может быть использовано в биотехнологии, медицине и ветеринарии для внешней оценки качества выявления маркеров различных вирусных или бактерийных инфекций в диагностических лабораториях МЗ РФ.

Источники научно-технической и патентной информаций
1. Контроль качества клинических диагностических лабораторных исследований. Принципы и методы. Москва - 1994, 154 стр.

2. Carrett А.J, Seagroatt V., Supran E.M. at all. "Бюллетень ВОЗ" 1988, vol. 66, N1, p. 44-60.

3. WНO Symposium. Report BS/96 1848. Geneva 1996.

4. Janot С., Courouсe A.-M., Maniez-Montreuil M. et al. Reevaluation of the sensivity of 19 HBs antigen screening kits. La Revue francaise des Laboratories, fevrier/mars 1996, N282 (translation).

5. Palomaki P. Simultaneous use of poly-and monoclonal antibodies as enzyme tracers in one-step enzyme immunoassay for the detection og hepatitits В surface antigen. J.Immunol. Methods, 1991, 145, 55-63.

6. Е.А. Гутова, А.Н. Канев, Е.Ю. Шалаев Стабилизирующий состав для контрольных сывороток положительных на антитела к вирусным и микробным антигенам. Патент РФ N2011202, 1993 г.

7. Информационный бюллетень фирмы Boston Biomedica, Inc., 1996, Hepatitis В surface antigen sensitivity panel (РНА806).

8. Peliсhесk sensitivity НВsAg panel. Central Laboratory of the Netherlands Red Cross. Amsterdam, 1996.

9. А. Н. Канев, А.П. Садовский, Е.Ю. Шалаев, М.Ю. Рукавишников. Способ определения технологических параметров лиофилизации биопрепаратов. Патент РФ N 2010220.

Изобретение относится к иммунологии и стандартизации и может быть использовано в технологии приготовления панели сывороток, содержащих антигены наиболее опасных вирусных инфекций, и в организации внешнего контроля лабораторных исследований. Сущность изобретения: панель содержит 5 нативных разведенных сывороток с концентрацией НВsAg от 1 МЕ/мл до 0,1 МЕ/мл, принадлежащих к различным субтипам НВsAg, и 3 нативных донорских сыворотки в качестве отрицательных образцов. Приготовленные сыворотки лиофильно высушивают до остаточной влажности не более 1,5 мас.%. Преимущество изобретения состоит в расширении спектра действия применяемой панели, а также увеличении сроков хранения. 1 с. и 4 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 ил.

1. Способ изготовления контрольных панелей сывороток для контроля качества диагностики гепатита В, включающий отбор реактивных сывороток лиц с диагнозом гепатит В для формирования положительных образцов панели и донорских сывороток, не содержащих специфические антитела к основным маркерам вирусных инфекций, изготовление разводящего раствора на основе отобранных донорских сывороток, разведение реактивных сывороток в разводящем растворе, проведение теста термодеградации для установления сроков годности панели, отличающийся тем, что формируют отрицательные образцы панели из сывороток, имеющих отрицательный результат в полимеразной цепной реакции на ДНК вируса гепатита В, а в иммуноферментном анализе - величину оптической плотности меньше критической в диапазоне 0,6-0,9 ОП крит. , а отбор реактивных сывороток для панелей проводят по схеме, которая включает их аттестацию методами иммуноферментного анализа и полимеразой цепной реакции на наличие ДНК вируса гепатита В, определение субтипа HbsAg и титрование положительных образцов панели, содержащих различные субтипы HbsAg, в разводящем стабилизированном растворе до требуемой концентрации HbsAg от 1 МЕ/мл до 0,1 МЕ/мл. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что отрицательные сыворотки референо-панели формируют из нативных сывороток. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве положительных образцов панели используют нативные сыворотки пациентов с диагнозом гепатит В, содержащие различные субтипы HbsAg. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для формирования контрольной панели отбирают 5 сывороток с концентрацией HbsAg от 1 МЕ/мл до 0,1 МЕ/мл и 3 нативных донорских сыворотки в качестве отрицательных образцов. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что приготовленные образцы контрольной панели лиофильно высушивают до остаточной влажности не более 1,5 мас. %.