СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАБОЧИХ СТАНДАРТОВ СЫВОРОТОК, СОДЕРЖАЩИХ AY И AD СУБТИПЫ HBsAg Российский патент 2006 года по МПК G01N33/96 

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии и может быть использовано в технологии изготовления контрольных образцов для тест-систем для выявления HBsAg.

Рабочий стандарт (PC) - это референс-препарат, который предназначен:

1. Для приготовления контрольных образцов для тест-систем для выявления HBsAg.

2. Для использования в качестве полуфабрикатов стандартных препаратов с низкой концентрацией HBsAg.

Известен референс-препарат ОСО (ГИСК им. Л.А.Тарасевича) для контроля диагностики гепатита В [1].

Недостатком его является то, что он изготовлен на основе неизвестного субтипа HBsAg и не позволяет эффективно контролировать образцы крови, т.к. его активность не может быть отнесена к определенному субтипу или генотипу HBV. Кроме того, одним препаратом невозможно решать проблемы контроля качества выполнения анализов в клинических диагностических лабораториях.

Наиболее близким (прототипом) является рабочий стандарт (working standard) AD субтипа (генотипа А), которые изготовляют в NIBSC и используют для контроля качества выполнения анализов на HBsAg в диагностических лабораториях инфекционных клиник и в центрах переливания крови Великобритании [2].

Британский PC приготовили следующим образом.

Используется сыворотка бессимптомного больного, который являлся носителем ВГВ (генотипа А) в течение, по крайней мере, 7 лет. Сыворотку разводят в соотношении 1:4 в воде для инъекций и последовательным нагреванием при температуре 60°С в течение 10 ч минимизируют инфекционность. Пастеризованную сыворотку разводят в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), содержащем 5% БСА и 0,1% азид натрия, и разливают по ампулам по 1 мл и хранят при температуре -20° и ниже.

Этому материалу в институте стандартов NIBSC (Potter Bar, UK) присвоили статус Британского стандарта AD субтипа со специфической активностью 100 British U/ампула.

Недостатками этого препарата являются:

1. Для изготовления PC используется модельный раствор (5% БСА), а не истинная человеческая сыворотка.

2. Используется только один субтип HBsAg - (AD).

Задачей изобретения является создание такого способа, который обеспечивал бы изготовление 2-х рабочих стандартов сывороток, содержащих AY и AD субтипы HbsAg, и позволил сохранить специфические характеристики этих образцов в течение длительного времени (не менее 1 года) при хранении от 2 до 6°С.

Поставленная задача решается изготовлением рабочих стандартов сывороток (PC), содержащих AY и AD субтипы HBsAg в концентрации от 5 до 10 МЕ/мл и имеющих вязкость, равную вязкости нормальной сыворотки человека (НЧС).

Схема изготовления Рабочих стандартов HBsAg субтипов AY и AD

1. Тестирование образцов донорских сывороток с помощью лабораторного стандарта HBsAg для изучения величины подавления аналитического сигнала от введенного количества HBsAg. Стандарт лаборатории (СЛ) - стабилизированный плазменный HBsAg, оттитрованный в российских и зарубежных тест-системах. Из донорских сывороток с минимальным уровнем подавления готовят разводящий раствор (РР).

2. Титрование препаратов HBsAg AY и AD субтипов в приготовленном РР вместе с ОСО Минздрава (производство "Диагностические системы", НН) и международными стандартами - NIBSC (Англия) - AD субтипа или института П.Эрлиха (ФРГ) - AY субтипа в различных тест-системах.

3. Определение коэффициента разведения для каждого субтипа для получения кандидата PC с концентрацией HBsAg 5-10 ME/ml.

4. Приготовление кандидатов PC AY и AD субтипов (в количестве 30-50 экземпляров каждого).

5. Определение концентрации HBsAg в PC по результатам ИФА в разных тест-системах в разных лабораториях.

6. Приготовление сухой стабилизированной формы кандидатов PC методом лиофилизации.

7. Проведение теста термодеградации кандидатов PC при повышенных температурах для определения срока годности.

8. Сертификация кандидатов PC в ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

Для установления взаимосвязи между аналитическим сигналом ИФА и массовой концентрацией HBsAg в растворе необходимо:

- изучить и привести в соответствие фракционно-дисперсный состав (ФДС) международного стандарта и тестируемого препарата;

- использовать ИФА тест-системы, которые в диапазоне от 1,5 МЕ/мл до 0,1 МЕ/мл демонстрируют прямолинейную связь между оптической плотностью и количеством HBsAg в растворе.

Для аттестации массовой концентрации препарата HBsAg в PC необходимо подбирать международный стандарт с идентичным ФДС. Различие ФДС референс-препаратов может объяснить тот факт, что коэффициенты пропорциональности между стандартами, используемыми в производстве тест-систем, не согласуются друг с другом. Испытания стандартов, проведенные под эгидой ВОЗ, показали, что 1 IU ВОЗ эквивалентна 0,584 единиц стандарта ин-та П.Эрлиха или эквивалентна 5,587 нг Abbott [3, 4]. Для оценки ФДС препаратов HBsAg, использованных при изготовлении национальных стандартов, применяют методы электронной микроскопии и атомной силовой микроскопии.

Важной проблемой при использовании HBsAg тест-систем в клинических диагностических лабораториях является правильность результатов анализа. Основным критерием правильности результатов серологического анализа служит аттестованное значение аналитического сигнала (например, ОП в ИФА) для каждой серии рабочего стандарта. Кандидаты PC титровали в различных матриксах: НЧС, 5% БСА и фетальная сыворотка относительно физиологического раствора с добавкой 0,2% казеина.

Материалы для изготовления PC

1. Разводящие растворы

В качестве РР используют следующие растворы:

- Нормальная человеческая сыворотка (НЧС);

- Раствор 5,5% БСА в 0,05 М фосфатно-солевом буфере (0,15 М NaCl) - ФСБ;

- Раствор 5,5% триптона в ФСБ;

- Раствор 0,2% казеина в ФСБ.

2. Тест-системы для выявления HBsAg

3. Стандартные препараты HBsAg

Далее следуют примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1.

Забор и предварительный анализ сывороток крови. Свежеприготовленную кровь из вены заливают в гемаконы, содержащие 0.12 мл 0.34 М ЭДТА, чтобы конечная концентрация ЭДТА составила 2 мМ (20 мл). Прямое разделение цельной крови проводят центрифугированием при 1000g в течение 15 мин при комнатной температуре. Надосадочную жидкость - сыворотку декантируют в стерильную посуду, визуально отбраковывают и хранят до использования в замороженном состоянии. Для приготовления стандартов используют прозрачные сыворотки с янтарным оттенком. Мутные и хилезные образцы отбраковывают.

Детекция ДНК ВГВ. ДНК ВГВ выявляют в образцах пула донорских сывороток и в плазменных препаратах при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР), как описано [5].

Анализ донорских сывороток включает:

1. Определение общего содержания белка.

2. Прозрачность и цветность.

3. Концентрация ионов водорода.

4. Сыворотки доноров анализируют на наличие анти-ВИЧ, анти-ВГС, анти-HBs и антител к сифилису и на HBsAg с использованием сертифицированных коммерческих тест-систем.

Для сертификации образцов PC дополнительно используют тест-системы: "HBsAg EIA Plus" (далее "HBsAg EIA") (Labsystems, Финляндия); "HBsAg/M" (Диагностические системы, Н. Новгород) и "Monolisa Ag HBs 2eme generation" (далее "Monolisa Ag HBs") (Sanofi Pasteur, Франция) [6].

Препараты HBsAg. Для приготовления рабочего стандарта субтипа AY используют плазменный очищенный HBsAg производства НПК "Препарат" (г. Нижний Новгород, РФ) (0.4 мг/мл, субтип AYw). В соответствии с паспортными данными содержание основного белка в препаратах превышает 95%, а примеси других белков в сумме не превосходят 1%.

В качестве препаратов AD субтипа HBsAg используют высокоочищенные плазменные или рекомбинантные белки, применяемые при изготовлении вакцин против гепатита В:

- Плазменный очищенный и концентрированный HBsAg, наработанный из пула сывороток инфицированных пациентов AD субтипа (GLD's Ltd., Singapore).

- Рекомбинантная (дрожжевая) вакцина субтипа ADW "H-B VAX II" производства компании "Merck Sharp&Dohme Haarlem" (Голландия), 10 мкг/мл. В качестве примесей вакцина может содержать менее 1% дрожжевого белка. Выделение HBsAg из вакцинных препаратов проводят в условиях щадящей десорбции частиц HBsAg с сохранением их структуры в 0.4М фосфатном буфере. Десорбированные препараты аттестуют по фракционно-дисперсному составу (ФДС) и концентрации HBsAg.

Анализ чистоты препаратов HBsAg выполняют методами гель-хроматографии, электрофореза и атомной силовой микроскопии.

Референс-препараты HBsAg. Для выполнения аттестационных определений в работе используют стандартные препараты, аттестованные в абсолютных или в относительных единицах:

- Отраслевой стандартный образец "OCO-HBsAg" (ГИСК им. Л.А.Тарасевича, Москва).

- Международный стандарт ВОЗ, код 80/549 ADW субтипа HBsAg, 100 IU/ml (NIBSC, UK).

Приготовление пула донорских сывороток. Из нативных сывороток крови, не содержащих маркеры вирусных инфекций, готовят пул не менее чем от 10 доноров.

Стабилизатор, включающий сахарозу, KCl, и Na-соль ЭДТА, добавляют в сухом виде при постоянном перемешивании в каждый пул с постоянным контролем вязкости раствора.

Стабилизированный пул сывороток используют в качестве разводящих растворов для приготовления PC субтипов AD и AY. Доводят рН раствора до 6.8-7.2 при комнатной температуре с помощью 0.1 N NaOH или 0.1 N HCl. В качестве бактерицидной добавки вводят мертиолят в количестве 0.012% от массы раствора и гентамицин в количестве 0,02% w/v. Растворы разливают стерильно в емкости по 250-500 мл и хранят при 2-8°С в течение не более 1 месяца. В замороженном виде, при температуре ниже минус 30°С, растворы можно хранить в течение 1 года.

Стабилизированный пул сывороток нормализуют по общему белку и вязкости относительно донорской сыворотки человека и получают разводящий раствор - PP. Контроль вязкости РР проводят с использованием стеклянного вискозиметра по классической методике с использованием калиброванного капилляра.

Приготовление образцов PC. Стабилизованный пул сывороток (РР) разделяют на 2 равные части: одну часть использовать для приготовления PC AY субтипа. Вторую часть используют для приготовления PC субтипа AD. Расчетное количество препаратов HBsAg, которые необходимо внести в РР для получения концентрации 5-10 МЕ/мл, определяют по кривым ИФА титрования AY и AD препаратов в РР одновременно с титрованием стандартных препаратов тех же субтипов.

Всего таким образом готовят 30-50 образцов-кандидатов PC.

Розлив и лиофилизация PC образцов. Приготовленные образцы PC фильтруют последовательно через 1.2 мкм фильтры для удаления дебриса и нерастворимых примесей стабилизатора, а затем через 0,45 мкм - для удаления микроорганизмов из растворов. Разливают по 800 мкл каждого PC во флаконы ФИ-5 при постоянном перемешивании для создания гомогенных условий в каждом флаконе. После розлива PC немедленно замораживают при температуре ниже -30°С.

Режим лиофилизации для выбранного состава стабилизатора подбирают по специально разработанной методике [7].

Испытания стабильности. Флаконы с лиофилизированными образцами PC выдерживают в термостатированных условиях при 37°С и 50°С, так как при температурах выше 56°С резко ухудшается растворимость таблеток. Через фиксированные промежутки времени часть флаконов изымают из термостатов и хранят при минус 20°С до тех пор, пока вся серия испытаний стабильности не будет завершена.

Образцы PC, выдержанные при разных температурах разное время, анализируют одновременно с образцами, все время простоявшими при минус 20°С (точка отсчета). Дополнительно следует тестировать сохранение свойств PC в жидком состоянии при хранении при 4°С в течение не менее 3-х месяцев.

Результаты измерения активности PC приведены в таблице 1.

Таблица 1
Уменьшение активности PC после хранения при разных температурах.Время хранения, суткиАктивность PC в процентахЛогарифм активности PC50°С37°С50°С37°С1234501001004,604,6794,097,54,544,581488,494,94,484,553076,889,54,344,4916224,155,03,184,01

В данной таблице 1 в графе 1 указано время хранения PC в сутках. Исходное значение активности в момент времени 0 суток принято за 100%. В графах 4-5 приведены натуральные логарифмы этих значений. Константу скорости дезактивации определяют как тангенс угла наклона прямой линии к оси абсцисс. Воспользовавшись этим, вычисляют константы скоростей, они оказываются равными 0,0037 1/сутки и 0,0088 1/сутки при температурах 37 и 50°С соответственно.

Условием стабильности будет предельное изменение активности PC не более чем на 10% от исходной величины. В этом приближении время хранения препарата составит

T=2,303·log(100/90)/K=369,7 дней или 1,03 года

Стабильность препаратов PC в жидком и лиофильном состояниях определяют термостатированием при повышенных температурах и в 3-кратном цикле замораживание-оттаивание.

По результатам теста ускоренной инактивации срок годности PC при 4-6°С составляет 1 год.

Пример 2. Экспертный отбор тест-систем

Используя метод разведения препаратов HBsAg для изготовления PC необходимо учитывать три основных фактора:

- эффективность диагностикума по отношению к AD и AY субтипам HBsAg,

- возможность подавления аналитического сигнала HBsAg в нативных сыворотках абсолютно здоровых доноров,

- исходную чистоту препаратов HBsAg, используемых для приготовления PC.

Для выполнения экспертизы по оценке эффективности тест-систем "Вектор Бест" и "БиАльгам" готовят два рабочих стандарта AD и AY субтипов разведением препаратов HBsAg в одинаковом РР, аттестованном по величине подавляющего эффекта. РР готовят из пула 9-10 донорских сывороток, каждая из которых показывает подавление аналитического сигнала в ИФА не более чем на 10%. После гомогенизации пула и введения компонентов стабилизатора

Рабочий стандарт AY субтипа готовят из плазменного AYW1-2 HBsAg (Н.Новгород) и

рабочий стандарт AD субтипа HBsAg (образец №10) готовят из плазменного ADW HBsAg компании "GLD's" (Singapore).

Аттестацию рабочих стандартов по концентрации HBsAg проводят при совместном титровании образцов PC и ОСО (20 МЕ/ампула) и с международным стандартом ADW субтипа HBsAg (100 IU/ампула, NIBSC).

Для определения специфических характеристик PC их титруют в различных буферных растворах (матриксах), т.к. в разных тест-системах используют разные РР. В таблице 2 приведены результаты титрования кандидатов PC обоих субтипов в растворах НЧС с добавками триптона и БСА качестве стабилизаторов.

Табл. 2.
Концентрация кандидата PC AY субтипа по результатам ИФА в двух тест-системахБуфер"Рекоматгеп В" Биальгам МЕ/мл"Рекоматгеп В" Вектор Бест МЕ/мл0,2% казеин в 0,05 М ФСБ7,16,53Фетальная Сыворотка11,698,225% р-р БСА в 0,05 М ФСБ13,317,71Среднее значение10,7 +/- 3,27,49 +/- 0,88Стандартный образецСЛ, 16 МЕ/млОСО, 20 МЕ/ампула

В данной таблице каждый производитель использует собственный стандарт для оценивания концентрации HBsAg. Как следует из таблицы, такой подход соответствует концентрации HBsAg, которая отличается почти в 1,5 раза.

Экономическая целесообразность набора рабочих стандартов заключается в том, что они могут быть использованы в одновременной аттестации тест-систем для выявления HBsAg в малых концентрациях и одновременно различных субтипов. В диагностических лабораториях PC могут использоваться в форме шифрованной пробы для контроля качества выполнения анализов сотрудниками лаборатории.

Источники информации

1. ОСО HBsAg Инструкция по применению, 1999 г.

2. Ferguson М., Pipkin PA, Heath AB, Minor PD: Working standards for hepatitis В surface antigen for use in the UK Blood Transfusion Service: Results of a collaborative study.//Vox Sang 1993, 65: 303-309.

3. J.A.J.Barbara. Questions of quality: how much HBsAg is there in this sample and is our assay sensitive enough to detect it? Vox sang 1993:65:249-250

4. M. Ferguson, A. Heath. WHO Working Group on Hepatitis and HIV Diagnostic Kits. WHO, Geneva, October 3-5,2003.

5. Larzul D., Guige P., Sninsky J.J. et al -Detection of hepatitis В virus sequences in serum by using in vitro enzymatic amplification. J. Virol. Methods 1988, 20, 227-237.

6. MONOLISA Ag HBs 2eme generation. Инструкция по использованию. Kit for detection of the surface antigen of hepatitis В by the enzyme immunoassay technique. Sanofi Pasteur, 1990.

7. Канев А.Н., Гутова Е.А., Шалаев Е.Ю. и др. Способ получения стандартной позитивной панели сывороток для контроля качества тест-систем и иммуноблотов. - Пат. №048529, 1996. РФ.

Изобретение относится к области иммунологии и может быть использовано в технологии изготовления контрольных образцов для тест-систем для выявления HBsAg. Сущность изобретения состоит в том, что отбор разводящих сывороток проводят путем анализа донорских сывороток методами иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции на наличие ДНК вируса гепатита В, анти HBs антител, факторов неспецифичного связывания HBsAg, причем в качестве разводящих сывороток выбирают сыворотки с отрицательным результатом в данных методах, титрование высоконцентрированных препаратов HBsAg в разводящем стабилизированном растворе до требуемой концентрации HBsAg (5-10 МЕ/мл) AY и AD субтипов. Техническим результатом является изготовление двух рабочих стандартов сывороток, содержащих AY и AD субтипы HBsAg, сохраняющих специфические характеристики этих образцов в течение длительного времени при хранении от 2 до 6°С. 3 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения рабочих стандартов сывороток AY и AD субтипов HBsAg, включающий отбор донорских сывороток, не содержащих специфические антитела к основным маркерам вирусных инфекций, разведение препарата HBsAg в разводящем растворе, проведение теста термодеградации для установления сроков годности рабочих стандартов, отличающийся тем, что отбор разводящих сывороток проводят путем анализа донорских сывороток методами иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции на наличие ДНК вируса гепатита В, анти HBs антител, факторов неспецифичного связывания HBsAg, причем в качестве разводящих сывороток выбирают сыворотки с отрицательным результатом в данных методах, титрование высоконцентрированных препаратов HBsAg в разводящем стабилизированном растворе до требуемой концентрации HBsAg (5-10 МЕ/мл) AY и AD субтипов.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для получения разводящего раствора используют пул 9-10 донорских сывороток, каждая из которых показывает подавление аналитического сигнала HBsAg в ИФА не более чем на 10%.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве препарата HBsAg используют плазменные очищенные и/или рекомбинантные антигены, принадлежащие к различным субтипам HBsAg и содержащие не менее 95% основного белка (антигена), причем каждый положительный образец панели в жидком состоянии имеет вязкость, равную средней вязкости пула сывороток здоровых доноров.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что приготовленные рабочие стандарты сывороток лиофильно высушивают до остаточной влажности не более 1,5 мас.%.