ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS FLUORESCENS ВКМ В-2224Д-ПРОДУЦЕНТ ВИТАМИНА В Российский патент 2002 года по МПК C12N1/20 C12P19/42 C12P19/42 C12R1/39 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий Pseudomonas fluorescens BKM В-2224Д, продуцирующего витамин В₁₂, который применяется как антианемический препарат в медицине и в производстве кормовых добавок для сельскохозяйственных животных и птицы.

В настоящее время промышленность использует для получения витамина В₁₂ только микробиологический синтез.

Известны способы получения микробиологическим способом витамина B₁₂ при помощи метанообразующих бактерий (Methanobacteria) патент США 3961971 (1976 г. ), пропионовокислых бактерий (патент США 4210720 (1980 г.), принадлежащим японской фирме Nippon Oil Company. В Японии фирма Дайсэру кагаку когэ к.к.. (ЕР 647717, 1994 год) производство витамина осуществляет при помощи бактерий Acenetobacterium, фирма Takeda Chemical Industries LTD (патент США 5545538) получает витамин В₁₂ с использованием бактерий Rhizobium Colalaminogenum FERMBP-4429, фирма Ниппон Сэкию к.к. (патент Японии 5-6996) в качестве продуцента витамина В₁₂ применяет штамм бактерий Propionibacterium shermani или frendenreiichii, устойчивых к пропионовой кислоте. При данных способах получения витамина В₁₂ концентрация витамина B₁₂ в культуральной жидкости не превышает 60-70 мкг/мл.

В России микробиологический синтез витамина В₁₂ при помощи бактерий Propionibacyerium shermani (патент 1737915) позволяет достигать концентрацию витамина В₁₂ в культуральной жидкости на уровне 40-50 мг/л (прототип).

Целью изобретения является получение штамма бактерий, способного синтезировать витамин В₁₂ в более высокой концентрации, чем известные микробные продуценты.

Сущность изобретения: штамм бактерий Pseudomonas fluorescens BKM В-2224Д - продуцент витамина В₁₂ получен путем многоступенчатой селекции и отбора активных по биосинтезу витамина B₁₂ вариантов из коллекционного штамма Pseudomonas fluorescens B98.

Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН под номером BKM В-2224Д.

При выращивании продуцента на ферментационной среде с мелассой, неорганическими солями и стимуляторами витаминообразования концентрация витамина В₁₂ в культуральной жидкости достигает величины 120-150 мкг/мл.

Штамм Pseudomonas fluorescens ВКМ В-2224Д характеризуется следующими признаками:
Культурально-морфологические признаки:
Бактерии представляют собой грамотрицательные подвижные палочки размером 0,45-0,85•0,6•15 мкм, неспорообразующие. На агаризованной среде образует округлые колонии 1-2 мм белого цвета. Клетки находятся в основном в скоплениях.

Штамм устойчив при пересевах на агаризованных средах.

Рост культуры на жидких питательных средах происходит параллельно с биосинтезом витамина В₁₂.

Температурный оптимум роста 30^oС. рН 7-7,2.

На твердой питательной среде с мелассой образуют бело-серые блестящие колонии, к концу 7 суток выражен центр, размер колоний 2-3 мм.

Факультативный аэроб.

Концентрация витамина B₁₂ определяется методом диффузии в агар с использованием культуры Е.Соli. 113-3 и спектрофотометрическим - принцип которого состоит в трансформации кофермента B₁₂ в кобаламин нитрит. Концентрация кобаламина определяется на спектрофотометре при длине волны 361 нм.

Для поддержания штамма используют агаризованные среды с мелассой следующего состава, г/л:
Меласса - 100,0
Аммоний фосфорнокислый двузамещенный - 1,5
Сернокислый аммоний - 0,3
Агар микробиологический - 20,0
Вода - До 1 л
рН - 7,0-7,2 ед.

Физиолого-биохимические признаки:
Не гидролизует желатин, крахмал, гидролизует лецитин. В качестве источника углерода усваивает сахарозу, бетаин, не усваивает глюкозу, ассимилирует глутаминовую, пропионовую кислоты. Рост при 42^oС варьирует. Денитрификация варьирует.

Хранение культуры
Хранят штамм в виде лиофильно-высушенной культуры при температуре 4^oС в течение 2-3 лет или на агаризованных средах при постоянных пересевах.

Условия биосинтеза витамина В₁₂ штаммом Pseudomonas fluorescens BKM В-2224Д
Биосинтез витамина В₁₂ культурой Pseudomonas fluorescens BKM В-2224Д осуществляется по следующей схеме: посевная культура на агаризованной среде --> посевная культура на колбах на жидкой среде --> культура на жидкой среде в посевном аппарате --> биосинтез на жидкой среде в ферментере.

Для получения посевного материала для засева посевных аппаратов используют среду следующего состава:
Меласса - 6-12%
Двуосновной фосфат аммония - 0,01-0,1%
Кобальт хлористый - 0,001-0,003%
Магний сернокислый - 0,1-0,3%
Марганец сернокислый - 0,01-0,05%
Цинк сернокислый - 0,002-0,02%
5-6-диметилбензилимидазол - 0,001-0,003%
Вода - До 1000 л
рН среды - 7,0±0,2 ед.

В качалочную колбу объемом 750 мл с объемом среды 50 мл вносят культуру из пробирки в количестве 0,1%.

Выращивают культуру при температуре 30^oС в течение 48 часов.

Полученной культурой в дозе не менее 0,1% засевают стерильную питательную среду в посевном аппарате следующего состава:
Меласса - 6-12%
Двуосновной фосфат аммония - 0,01-0,1%
Кобальт хлористый - 0,001-0,003%
Магний сернокислый - 0,1-0,3%
Марганец сернокислый - 0,01-0,05%
Цинк сернокислый - 0,002-0,02%
5-6-диметилбензилимидазол - 0,001-0,003%
Вода - До 100%
рН среды - 7,0±0,2 ед.

Условия ферментации: постоянное перемешивание, температура 28-32^oС, при подаче воздуха 02-05 л/л среды в мин в течение 40-60 часов до оптической плотности больше 0,2.

Полученным посевным материалом в дозе засевают стерильную ферментационную среду следующего состава:
Меласса - 14-20%
Сахароза - 2,0-5,0%
Глицерофосфорная кислота - 0,2-0,4%
Кобальт хлористый - 0,01-0,03%
Холинхлорид - 1,0-2,0%
Магний сернокислый - 0,1-0,3%
Окись магния - 0,05-0,07%
Сернокислый аммоний - 0,2-0,4%
Цинк сернокислый - 0,05-0,1%
Хлористый кобальт - 0,01-0,02%
5-6-диметилбензилимидазол - 0,01-0,02%
Глицерин - 0,1-0,2%
Вода водопроводная - До 100%
рН среды - 7,0±0,2 ед.

Ферментацию проводят при температуре культуральной жидкости 28-32^oС, при постоянном перемешивании, избыточном давлении 0,5 ати, при расходе воздуха 0,2 л/л среды в мин.

Культура Pseudomonas fluorescens BKM В-2224Д характеризуется тем, что ее рост происходит параллельно с биосинтезом витамина В₁₂ в аэробных условиях на протяжении всего процесса ферментации.

Содержание витамина В₁₂ в культуральной жидкости к концу ферментации составляет 120-150 мкг/мл при определении микробиологическим методом с использованием в качестве тест-культуры Е.соli 113-3 или спектрофотометрическим методом. При культивировании пропионово-кислых бактерий содержание витамина B₁₂ в культуральной жидкости равно 40-50 мкг/мл.

По окончании процесса ферментации культуральную жидкость подкисляют серной кислотой до значения рН 5,8 ед., проводят лизис культуры при температуре 90±10^oС. Для получения готового продукта культуральная жидкость может быть переработана на распылительной сушилке с наполнителями (мел, соль, отруби и др. ) или отправлена на стадии получения и выделения витамина B₁₂ в чистом виде.

Результаты проверки уровня биосинтеза витамина B₁₂ культурой Pseudomonas fluorescens ВКМ В-2224Д в лабораторных условиях приведены в табл.1
Результаты проверки уровня биосинтеза витамина B₁₂ культурой Pseudomonas fluorescens ВКМ В-2224Д в опытно-промышленных условиях (в аппаратах объемом 2,5 м³) приведены в табл.2
Источники информации
Патент России 1737915, С 12 Р 19/42 - прототип.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма, продуцирующего витамин В₁₂. Штамм бактерий Pseudomonas fluorescens ВКМ В-2224Д - продуцент витамина В₁₂ растет при 28-32^oС и рН 7-7,2 и постоянном перемешивании. Рост культуры происходит параллельно с биосинтезом витамина В₁₂ в аэробных условиях. Продуктивность культуры за 150 ч роста ферментации составляет 130-150 мкг/мл. 2 табл.

Штамм бактерий Рseudomonas fluorescens ВКМ B-2224Д - продуцент витамина B₁₂.