ШТАММ БАКТЕРИЙ BAC. THURINGIENSIS VAR. KURSTAKI ВКМ В-2248Д, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2002 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/07 

Использование: изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма Bacillas thuringiensis var.kurstaki B-159/252B.t. Спорообразующие бактерии Вас. thuringiensis были выделены из природных очагов гибели насекомых более 80 лет назад и до настоящего времени являются наиболее известными во всем мире микроорганизмами, применяемыми в производстве энтомопатогенных препаратов.

Энтомоцидные свойства клеток Вас. thuringiensis, каждая из которых продуцирует спору и ромбовидный белковый кристалл, принадлежат исключительно эндотоксину, который является основным компонентом кристалла. Кристалл в кишечном тракте насекомого переходит в растворимое состояние, вызывает образование протоксина, который активизируется в результате реакции протеолиза.

Промышленное производство препаратов на основе Вас. thuringiensis var. kurstaki требует их отбора по параметрам технологичности для крупномасштабного культивирования: высокая продуктивность, устойчивость к спектру производственных фагов, высокая биологическая активность.

Совместить эти параметры в одном продуценте очень сложно, что затрудняет текущую селекционную работу с производственными культурами.

Известен импортный препарат дипел, получаемый с использованием штамма Вас. thuringiensis var. kurstaki NRRLB-18196 (а.с. СССР 1837773).

В бывшем СССР отечественный препарат лепидоцид получали с использованием штамма Вас. thuringiensis var. kurstaki Z-52 (а.с. СССР 769787)и штамма Вас. thuringiensis var. kurstaki Z-86 (а.с.СССР 1530159).

Целью изобретения является получение штамма Вас. thuringiensis var.kurstaki, способного обладать более высокой биологической активностью и большей устойчивостью к существующим фагам,чем известные штаммы.

Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (г. Москва)под номером ВКМ В-2248Д.

Сущность изобретения: штамм бактерий Вас. thuringiensis var. kurstaki В-159/252 В. t. ВКМ В-2248Д выделен из природного материала с мест естественной гибели насекомых.

Штамм характеризуется повышенной биологической активностью и большей устойчивостью к производственным фагам.

Полученный штамм обладает следующими свойствами.

Морфолого-культуральные.

Аэроб. Граммположителен. Вегетативные клетки - крупные палочки с закругленными концами, расположенные одиночно, парами или цепочками. Размер клеток-(1,7-1,9)•(3,5-6,9) мкм.

Морфологической особенностью является наличие в одной споре двух белковых патогенных для насекомых параспоральных включений - кристалл-токсинов ромбовидной и квадратной формы с четкими гранями.

Температура выращивания 30^oС.

На мясопептонном бульоне образует гладкую сплошную пленку через 48-72 часа. Рост умеренный.

На ломтиках картофеля образует крупные плоские колонии с шероховатой матовой поверхностью. Рост обильный. Пигмент не образует.

На молочном агаре образует крупные, с шероховатой поверхностью колонии белого цвета, вокруг которых образуется зона просветления. Рост обильный.

На пептоно-кукурузном агаре образует крупные, плоские с шероховатой матовой поверхностью колонии с ветвистым краем. Рост обильный.

На кровяном агаре образует крупные с ветвистым краем колонии белого цвета. Поверхность колонии шероховатая, маслянистая. Рост обильный.

Культура на твердых средах растет 24 -48 часов.

Физиолого-биохимические.

Использует глюкозу, мальтозу, кукурузный и картофельный крахмал, соевую и кукурузную муку, кукурузный экстракт.

Отношение к источникам углерода.

Не использует лактозу, глицерин, сахарозу, ксилозу, маннозу.

Отношение к источникам азота.

Органические источники азота, используемые данными микроорганизмами: пептоны, мясные, рыбные и растительные экстракты, соевая, кукурузная и рыбокостная мука, автолизаты дрожжей и казеина, гидролизаты из кукурузной и соевой муки, кормовые дрожжи.

Усваивает аммонийные и нитратные формы азота.

Хранение культуры
Культура хорошо хранится в холодильнике при температуре +4-6^oС на косяках со средой "Б", для длительного хранения помещается под слой стерильного вазелинового масла или лиофильно высушивается.

Размножается на агаризованной среде МПА при температуре 28-30^oС. Оценка свойств культуры проводится после ее культивирования на круговой качалке 200 об/мин на стерильной питательной среде следующего состава в %:
Дрожжи кормовые - 2,8
Мука кукурузная - 2,0
Мука соевая - 0,8
Натрий хлористый - 0,1
Калий сернокислый - 0,1
Хлористый кальций - 0,1
Аммоний фосфорно- кислый однозамещенный - 0,2
рН среды - 6,8-7,2
в качалочных колбах с объемом среды 15 мл,
Температура культивирования 28-30^oС.

Длительность ферментации 48 часов до высыпания спор на 70-90%.

Сравнительные характеристики штамма Вас. thuringiensis var. kurstaki B-159/252B. t. и производственного штамма Z-52 и Z-86 при культивировании на ферментационной производственной среде при производстве лепидоцида приведены в таблице (данные 5 опытов в 3-х повторностях)
Таким образом, представленные данные показывают, что штамм В-159 существенно превышает по биологической активности производственный штамм Z-52, сравним с ним по продуктивности и обладает устойчивостью к большему числу производственных фагов.

Пример. В 5-параллельных опытах проведено культивирование штаммов В-159/252В. t, / Z-52 и Z-82 в качалочных колбах емкостью 750 мл с 30 мл дрожжеполисахаридной питательной среды.

Количество посевного материала - 0,1% к объему питательной среды. Время ферментации на качалке с числом оборотов 200 об/мин при температуре 30+1^oС - 48 часов. По окончании ферментации проведен анализ культуральной жидкости.

Культура штамма B-159/252B.t. развивалась синхронно, освобождение спор и кристаллов происходило на 40-48 часов роста. Кристаллы крупные, хорошо видимые при окраске фуксином. Биологические пробы проведены на гусеницах непарного шелкопряда 2 возраста при свободном поглощении корма гусеницами. Отношение к фагам определялось методом скот-теста.

Практическое использование штамма в производстве лепидоцида позволит сократить производственные потери от фаговых (трапных) операций и повысит качество выпускаемой продукции по уровню биологической активности.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма, используемого для получения энтомопатогенных препаратов. Штамм Bacillus thuringiensis var. kurstaki выделен из природного материала с мест естественной гибели насекомых и депонирован в коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН под номеров ВКМ В-2248 Д. Штамм имеет повышенную биологическую активность и большую устойчивость к производственным фагам. 1 табл.

Штамм Bacillus thuringiensis var. kurstaki BKM B-2248Д для получения энтомопатогенных препаратов.