СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ СЕПСИСА У НОВОРОЖДЕННЫХ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/68 G01N33/573 

Изобретение относится к области медицины, в частности к неонатологии, и найдет использование для ранней лабораторной диагностики септической инфекции у новорожденных.

Неонатальный сепсис до сих пор занимает одно из ведущих мест в структуре заболеваемости среди новорожденных, составляя летальность до 13-50%. (Acunas В. A. , Peakman М., Liossis G. et al. Effect of freshfrozen plasma and gammaglobulin on humoral immunity in neonatal sepsis //Arch. Dis. Child. Fet. - 1994. - Vol. 70, 3. - P. 182-187; Barry D.M.J., Reeve M.R. Increaesed incidence of Gram-negative neonatal sepsis with intramuscular iron administration // Pediatrics. 1977. - Vol. 60. - P. 908-912; Эрикссон М., Беннет Р., Цеттерштрем Р. и др. Современные аспекты сепсиса новорожденных // Вестн. АМН СССР. - 1985. - 6. - С. 18-25). Наиболее тяжелая ситуация сложилась в отделениях реанимации и интенсивной терапии, где находятся дети из группы высокого риска, определяемой основным заболеванием, материнским анамнезом, повышенной восприимчивостью к инфекциям. Это обусловлено невозможностью иммунной системы на любом уровне эффективно локализовать бактериальную агрессию, использованием инвазивных методов диагностики, мониторинга, респираторного оборудования и наличием в отделениях своей устойчивой флоры, способствующей развитию тяжелых нозокомиальных инфекций. Используемый арсенал ранее известных методов диагностики развития септической инфекции не всегда отвечает требованиям современности. Таким образом, работу в этом направлении следует продолжить.

В настоящее время известны следующие методы лабораторной диагностики сепсиса.

Микробиологические, которые основаны на выделении и идентификации микробного агента из крови на искусственных питательных средах. (Бочков И.А., Овчарова Н. М. Бактериальная колонизация и сукцессия у новорожденных в аспекте проблемы госпитальных инфекций // Журн. микробиол. - 1991. - 8. - С. 71-75; Васильева Л.И. Микробные биоценозы новорожденных в условиях нормы и септических заболеваний: Автореф. дис.... докт. мед. наук. - Ростов-на-Дону, 1990. - 32 с.; Васильева Л.И. Микробный биоценоз у новорожденных в норме и при септических заболеваниях // Педиатрия. - 1991. - 5. - С. 27-30).

Микробиологический метод занимает много времени, трудоемок и результаты не всегда своевременны.

Методы биохимической бактериологии косвенно свидетельствуют о присутствии возбудителя в крови, поскольку они основаны на действии микробных ферментов на характерные для них субстраты (оксидазный, индоловый галактозидазный, глюкуронидазный и ксилозидазный). (Елинов М.П., Химическая микробиология, М. : Медицина, 1989, Глоба А.Г. Исследования некоторых биохимических компонентов ответа нейтрофилов в норме и патологии, М.: Медицина, 1991). Однако эти методы не годятся для ранней диагностики сепсиса, поскольку они низкочувствительны и малоспецифичны, и могут быть отнесены только к дополнительным, ориентировочным тестам.

Идентификация микробной ДНК в крови с помощью PCR-реакции, основанный на амплификации специфических участков ДНК возбудителя. (Федюшкина Н.А., Видута О. Д. , Заплатников А.Л., Щербо С.Н. Диагностика внутриутробных инфекций методом полимеразной цепной реакции, М.: Медицина, 1998 г.; Сухова Л.П., Машеро В. В. Сравнительный анализ ПЦР, иммуноферментного и культурального методов исследования, М. : Медицина, 1998 г.). Метод высокочувствителен и специфичен, но не может охватить весь спектр микроорганизмов, вызывающих бактериемию.

Прототипом предлагаемого изобретения выбран способ ранней диагностики сепсиса путем проведения исследования С-реактивного белка методом радиальной иммунодиффузии по Манчини и исследования циркулирующих иммунных комплексов путем преципитации 3,5% полиэтиленгликолем. Среднее значение данных параметров в разгар заболевания составляет соответственно 150+28 мг/мл и 0,160+0,11 ед. (Карапетян Л. В. и др. // Сб. научных трудов "Актуальные вопросы снижения материнской и детской смертности" - М., 1988 г., с. 79-82).

Указанный способ обладает следующими недостатками:
- длительность проведения анализа - инкубация рабочего материала в термостате в течение суток;
- относительно низкая точность способа за счет субъективной оценки результатов исследования;
- трудоемкость исследования.

Задачей изобретения является разработка более совершенного, высокочувствительного метода ранней диагностики септической инфекции у новорожденных.

Поставленная задача решается тем, что у новорожденных через каждые 12 часов определяют провоспалительные доиммунные цитокины - фактор некроза опухолей (ФНО) и интерлейкин-8 (ИЛ-8), в сыворотке крови и при концентрации ИЛ-8>5 пг/мл и ФНО>2 пг/мл выявляют септический процесс. Цитокины или интерлейкины - это класс молекул, обладающих регуляторной активностью, которые принимают участие в межклеточных взаимодействиях в иммунологических реакциях в ответ на внедрение чужеродного микробного агента. Выработку доиммунных цитокинов стимулируют непосредственно инфекционные микроорганизмы в моноцитах/макрофагах, кератиноцитах кожи, и других клетках барьерной ткани. В системной циркуляции можно выявить только доиммунные цитокины, такие как ФНО и ИЛ-8, но не в норме а при септических процессах, поскольку цитокины никогда не выходят в циркуляцию в кровь и действуют только локально в микроокружении по месту выработки. Поэтому мониторинговое определение цитокинов в крови новорожденного позволит с высокой степенью вероятности выявить септический процесс в самой ранней стадии.

Подробное описание способа и примеры его практического применения.

Способ осуществляется следующим образом.

При поступлении в отделение реанимации у новорожденного берут 1 мл венозной крови, центрифугируют 3 мин при 5000 об./мин. 100 мкл полученной сыворотки вносят в микротитражные лунки планшет от набора для определения ИЛ-8 и ФНО. Одновременно в свободные лунки вносят по 100 мкл положительные образцы, содержащие определенное количество ИЛ-8 и ФНО для построения стандартной кривой. Инкубируют планшет 120 мин при 37^oС. После пятикратной промывки лунок забуференным физраствором с твином лунки хорошо встряхивают и вносят 100 мкл конъюгата 1 (-биотинилированные антитела к ИЛ-8 или ФНО), инкубируют при 37^oС 60 мин. Промывают так же, как описано выше, планшет встряхивают и вносят в каждую лунку по 100 мкл конъюгата 2 (стрептавидин, меченный пероксидазой хрена), инкубируют 20 мин при 37^oС. После пятикратной промывки в лунки вносят 100 мкл субстратного буфера и 100 мкл раствора субстрата. Инкубируют 20 мин при комнатной температуре, добавляют 50 мкл стоп-реагента (2NH₂SО₄). Оптическую плотность цветной реакции регистрируют на фотометре (Labsystems Multiskan Plus, Финляндия) при длине волны 450 нм. И по стандартной кривой рассчитывают количество ИЛ-8 и ФНО в сыворотке. Цифры концентраций цитокинов ИЛ-8>5 пг/мл и ФНО>2 пг/мл в сыворотке свидетельствует о развитии септической инфекции.

Работоспособность изобретения подтверждается следующими конкретными примерами.

Пример 1.

Ребенок Ш-ков, первых суток жизни, история болезни 46/087. Дыхательная недостаточность (ДН) развилась в связи с аспирацией мекония через 2 часа. Ребенок переведен на искусственной вентиляции (ИВЛ) в отделение реанимации. При поступлении уровень в сыворотке ИЛ-8 и ФНО не выявлен. Последующие через 12 часовое определение данных интерлейкинов отрицательное. На 3-и сутки пребывания в отделении в крови определяется уровень ИЛ-8 65,6 пг/мл и ФНО - 115,8 пг/мл. У ребенка появилось гнойное отделяемое из эндотрахеальной трубки. При проведении санационной бронхоскопии гнойный трахеобронхит. Произведена смена антибиотика. Дальнейший мониторинг за концентрацией ФНО и ИЛ-8 показал динамику к снижению. На 6-ые сутки у ребенка наступило клиническое улучшение, цифры ФНО и ИЛ-8 снизились соответственно до 0,89 пг/м и 3,8 пг/мл. Ребенок снят с искусственной вентиляции легких на 10-ые сутки и переведен для дальнейшего лечения в отделение патологии новорожденных. При переводе признаки септической инфекции отсутствуют. Уровни цитокинов в крови не выявлены.

Пример 2.

Ребенок Б-нов, 4-ых суток жизни, история болезни 34/4087. Находился в родильном доме с диагнозом гемолитическая болезнь новорожденных по группе крови (ГБН по АВО). На 4-ые сутки переведен в реанимационное отделение на ИВЛ в связи с нарастанием дыхательной недостаточности. При поступлении признаки инфицирования отсутствуют, однако в крови определяется высокий уровень ИЛ-8 - 1235,9 пг/мл и ФНО - 342,9 пг/мл. На 2-ые сутки пребывания в отделении у ребенка появилось творожистогнойное отделяемое из эндотрахеальной трубки. Диагностирован гнойный трахеобронхит. На 3-и сутки у ребенка отмечены симптомы генерализации инфекции: серые кожные покровы, гепатоспленомегалия, парез кишечника 3-ей степени. В крови лейкоцитопения со сдвигом до юных, на рентгенограмме - 2-сторонняя сливная пневмония, из крови высеян S. Aureus. Цифры определяемых интерлейкинов остаются высокими (ИЛ-8 - 657,8 пг/мл, ФНО - 257,6 пг/мл). Произведена смена антибиотиков. В процессе лечения отмечено постепенное купирование симптомов септического процесса.

Цифры определяемых интерлейкинов соответственно снизились до ИЛ-8 3,8 пг/мл и ФНО 1,78 пг/мл.

Длительность пребывания на ИВЛ 23 дня.

Пример 3. Ребенок А-ров., 1-ых суток жизни, история болезни 25/4117. Доставлен в отделение реанимации на ИВЛ в связи с нарастанием дыхательной недостаточности. При поступлении в отделении в сыворотке крови ИЛ-8 и ФНО не выявлены. В анализах крови без особенностей. В отделении ребенку диагностирована полная атрезия пищевода. За время нахождения в отделении уровень в крови интерлейкинов не повышался, признаков инфицирования не обнаружено. Данные общих анализов крови без особенностей. На 3-и сутки на ИВЛ переведен в отделение реанимации 20-ой детской больницы для хирургического лечения.

Предлагаемым методом было обследовано 17 новорожденных, находящихся на ИВЛ. У 8 детей уровень интерлейкинов значительно превышал допустимые границы, что позволило предположить у них септическую инфекцию уже на ранних этапах развития заболевания. В последующем диагноз неонатальный сепсис у этих новорожденных был подтвержден бактериологически.

Таким образом, исследование уровня интерлейкинов в крови у 17 новорожденных, находящихся на ИВЛ, показало, что точность заявляемого способа составляет 89,9%.

Исходя из вышеизложенного заявляемый способ диагностики септической инфекции у новорожденных по сравнению с существующими имеет следующие преимущества:
1. Способ позволяет диагностировать септическую инфекцию в доклинической фазе и на протяжении всего заболевания.

2. Способ относится к экспресс-диагностике (время выполнения 2 часа).

3. Предлагаемый способ обладает высокой точностью и найдет широкое применение не только в отделениях реанимации, но и в других педиатрических отделениях.

Изобретение относится к области медицины, в частности к неонатологии, и может быть использование для ранней лабораторной диагностики септической инфекции у новорожденных. Способ заключается в исследовании уровня цитокинов: интерлейкина-8 (ИЛ-8) и фактора некроза опухоли (ФНО) и при концентрации ИЛ-8 более 5 пг/мл и ФНО более 2 пг/мл диагностируют развитие септической инфекции. Техническим результатом является получение высокочувствительного метода ранней диагностики септической инфекции у новорожденных, что позволяет поставить клинический диагноз с наибольшей степенью вероятности и в максимально ранние сроки.

Способ ранней диагностики сепсиса у новорожденного, отличающийся тем, что в сыворотке крови путем иммуноферментного анализа определяют провоспалительные цитокины: фактор некроза опухоли (ФНО) и интерлейкин-8 (ИЛ-8) и при концентрации ФНО больше 2 пг/мл и ИЛ-8 больше 5 пг/мл диагностируют начало септического процесса.