СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ У НОВОРОЖДЕННЫХ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/49 C12N15/10 

Изобретение относится к области медицины, а именно к неонатологии, и может быть использовано для ранней лабораторной диагностики бактериальных инфекций у новорожденных. Инфекционные заболевания выявляют у 50-60% госпитализированных доношенных и у 70% недоношенных новорожденных. Наиболее тяжелая ситуация сложилась в отделениях реанимации и интенсивной терапии, где находятся дети из группы высокого риска развития бактериальных инфекций.

Очевидно, что рутинные методы диагностики в условиях терапии экстремальных состояний малоприемлемы из-за своей длительности и использования для исследования больших количеств биологических жидкостей.

В настоящее время известны следующие методы лабораторной диагностики бактериальных инфекционных заболеваний. Микробиологические, которые основаны на выделении и идентификации микробного агента из крови на искусственных питательных средах (И.А. Бочков, Н.М. Овчарова. "Бактериальная колонизация и сукцессия у новорожденных в аспекте проблемы госпитальных инфекций" // Журн. микробиол. -1991. - 8. - С. 71-75). Микробиологический метод занимает много времени, трудоемок и результаты не всегда своевременны. Методы биохимической бактериологии косвенно свидетельствуют о присутствии возбудителя в крови, поскольку они основаны на действии микробных ферментов на характерные для них субстраты (оксидазный, индоловый галактозидазный, глюкуронидазный и ксилозидазный) (А.Г. Глоба "Исследования некоторых биохимических компонентов ответа нейтрофилов в норме и патологии", M., "Медицина", 1991). Однако эти методы не могут использоваться для ранней диагностики сепсиса, поскольку они низкочувствительны и малоспецифичны, могут быть отнесены только к дополнительным, ориентировочным тестам.

Прототипом предлагаемого изобретения выбран способ диагностики бактериальных инфекций новорожденных, описанный Benitz W.E., Han M.Y., Madan A., Ramachandra P. "Serial serum C-reactive protein levels in the diagnosis of neonatal infection" ("Pediatrics" 1998 Oct; 102(4): E 41). Сущность способа состоит в том, что в первые дни после рождения у новорожденного берут кровь и в сыворотке серологическим методом (реакция иммунодиффузии по Манчини) определяют С-реактивный белок (СРБ). Повышение уровня СРБ более 6 мг/дл свидетельствует о развитии инфекционного процесса. Недостатком прототипа является невысокая точность и чувствительность способа. По данным литературы чувствительность определения СРБ составляет 60%, специфичность 50% (Anwer S.К. , Mustafa S. Rapid identification of neonatal sepsis. JPMA J. Pak. Med. Assoc. 2000 Mar; 50 (3): 94-98. Кроме того, ряд авторов указывают на ненадежность СРБ - как диагностического маркера при ранней диагностике новорожденного сепсиса (Ronnestad A, Abrahamsen TG, Gaustad P, Finne PH. C-reactive protein (CRP) response patterns in neonatal septicaemia, APMIS 1999 Jun; 107(6): 593-600; Kono Т, Otsuka M, Ito M et ai. Negative C-reactive protein in children with bacterial infection. Pediatr Int 1999 Oct; 41 (5): 496-9).

Задачей изобретения является разработка более точного, высокочувствительного метода ранней диагностики бактериальных инфекций у новорожденных на доклинической стадии. Поставленная задача решается тем, что у новорожденных в крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием диагностических праймеров, специфичных к 16S rDNA- и 23S rDNA-участкам эубактерий, определяют наличие ДНК эубактерий в лейкоцитах крови и при их обнаружении диагностируют развитие бактериальной инфекции.

Тяжесть состояния новорожденных с респираторной патологией и перинатальным поражением центральной нервной системы вследствие основного и сопутствующих заболеваний, особенность иммунологических механизмов, характерных для перинатального периода - далеко не полный перечень факторов, определяющих специфичность иммунного статуса данной группы пациентов. Нашими исследованиями установлено, что мониторинговое исследование и обнаружение ДНК эубактерий с использованием диагностических праймеров, специфичных к 16S rDNA- и 23S rDNA-участкам эубактерий в лейкоцитах крови новорожденного, позволяет с высокой степенью вероятности выявить развитие бактериальной инфекции в самой ранней стадии.

Обнаружение ДНК эубактерий с использованием диагностических праймеров, специфичных к 16S rDNA- и 23S rDNA-участкам эубактерий, ранее описано как признак инфицирования околоплодных вод (R. Aaltonen et al., "Neonatal infection after premature rupture of membranes evaluated with bacterial polymerase chain reaction". Prenat Neonat Med 1998:3:334-339), однако в крови новорожденных данный маркер не исследовался никем.

Работоспособность изобретения подтверждается следующими конкретными примерами.

Пример 1. Ребенок Н., первых суток жизни, история болезни 12/1360. Дыхательная недостаточность (ДН) развилась в связи с аспирацией мекония через 2 ч после рождения. Ребенок переведен на искусственную вентиляцию легких (ИВЛ) в отделение реанимации. У новорожденного в стерильных условиях берут 1 мл венозной крови в пробирку, содержащую 50 мкл гепарина, после чего в эту пробирку добавляют 1 мл 0,9% раствора хлористого натрия. В другую пробирку наливают 0,5 мл смеси фиколл-верофафин (ρ == 1,077 г/л), затем в нее добавляют 1,6 мл разведенной крови из первой пробирки. Пробирку центрифугируют 30 мин на скорости 1450 оборотов в минуту при температуре 18^oС. После центрифугирования из пробирки пипеткой отбирают кольцо, образованное на границе двух жидкостей, состоящее из лейкоцитов. После этого в стерильном боксе производят обработку клинической пробы перед проведением полимеразной цепной реакции. Для проведения исследования используют: центрифугу типа "Eppendorf", термостат - термоциклер, трансиллюминатор, оборудование для проведения электрофореза в полиакриламидном геле.

1. Предварительно готовят лизирующую смесь (см. табл. 1).

Смесь тщательно перемешивают пипетированием и разливают по 5 мкл в 1,5 мл пробирки, маркированные соответственно поступившим клиническим образцам.

2. Пробу центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин.

3. Удаляют пипеткой надосадочную жидкость, добавляют 200-1000 мкл буфера ТЕ (в зависимости от количества осадка) и тщательно ресуспендируют осадок.

4. 45 мкл суспензии добавляют к 5 мкл заранее приготовленной лизирующей смеси, тщательно перемешивают.

5. Пробирку помещают в термостат и выдерживают в течение 60-75 мин при 55^oС.

6. По истечении указанного времени температуру повышают до 95^oС и выдерживают пробирку 15 мин.

7. Пробирку вынимают из термостата и центрифугируют 30 с, при 10000 об/мин.

В дальнейшем производят подготовку для проведения полимеразной цепной реакции.

1. Готовят 0,5 мл пробирки для проведения ПЦР, пронумеровав и расположив их соответствующим образом в штативе. Необходимо предусмотреть пробирки для положительного и отрицательного контролей.

2. Вынимается набор для проведения ПЦР, размораживается и пробирки с реактивами помещаются на ледяную баню.

3. Готовится общая смесь для проведения ПЦР.

4. ЛЦР проводят в объеме 25 мкл; реактивы тщательно перемешивают и в каждую пробирку вносят:
- 22 мкл общей реакционной смеси, 1 мкл лизата клинического образца, 1 каплю минерального масла для ПЦР, используя пипетку на 1000 мкл. В пробирку для отрицательного контроля вместо лизата добавляют 1 мкл деионизованной воды, в пробирку для положительного контроля - 1 мкл образца, содержащего 10000 микробных клеток штамма St. aureus, рассчитанного по стандарту мутности.

5. Пробирки закрывают и центрифугируют 3-5 с.

6. Необходимое количество Biotaq полимеразы разводят деионизированной водой в соотношении полимераза : вода = 1 : 10 и помещают на ледяную баню.

7. Пробирки помещают в ДНК-амплификатор. В каждую пробирку добавляют по 2 мкл разведенной полимеразы после проведения горячего старта непосредственно на амплификаторе. Добавление проводят под масло отдельным наконечником для каждой пробирки.

8. Проводят ПЦР по программе.

Определение эубактерий. Обозначение праймеров:
BactF forward; BactR reverse
Состав общей смеси для ПЦР (см. табл. 2).

В каждую пробирку наливают по 22 мкл общей смеси. Деионизованной водой разводят Taq-полимеразу в 10 раз и добавляют в каждую пробирку по 2 мкл после горячего старта под масло.

Программа ПЦР: горячий старт 30 циклов.

94^oС - 5 мин, 94^oС - 1 мин, 55^oС - 1 мин, 72^oС - 1 мин.

Регистрация результатов амплификации
1. В аппарат для вертикального электрофореза залить однократный ТВЕ буфер, приготовленный на дистиллированной воде.

2. Готовят акриламидный (АА) гель для вертикального электрофореза. Для приготовления 25 мл 7% АА геля необходимо смешать:
16,5 мл воды, 2,5 мл 10Х ТВЕ буфера, 5,5 мл 30% акриламида (акриламид: бисакриламид = 29: 1), 300 мкл 10% ПСА, 40 мкл ТЕМЕД.

3. После застывания гель помещают в аппарат для электрофореза, вынимают гребенку, промывают карманы геля ТВЕ-буфером.

4. В каждую амплификационную пробирку добавляют под масло по 5 мкл краски-буфера для нанесения проб.

5. Наносят в карманы геля по 10-15 мкл амплификата, смешанного с буфером для нанесения проб в последовательности, соответствующей нумерации образцов. Наносят на гель положительный и отрицательный контроли и маркер для определения молекулярного веса фрагментов ДНК.

6. Подключают аппарат к источнику тока и проводят электрофоретическое разделение продуктов амплификации при напряжении 270 В в течение 1,5 ч.

7. Вынимают гель из камеры, освобождают его от стекол и окрашивают в растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл).

8. Переносят гель на стекло трансиллюминатора. Включают трансиллюминатор и анализируют результаты ПЦР. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся оранжевых полос. При анализе результатов ПЦР присутствие полосы строго на уровне соответствующего контроля свидетельствует о наличии данного возбудителя в пробе. Появление полосы в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации компонентов набора, в этом случае необходимо выяснить ее причину, а затем повторить эксперимент.

9. Полученные результаты документируют фотографированием гелей в УФ свете с использованием оранжевого светофильтра. Анализ полученных результатов:
При исследовании крови по данной методике при обнаружении в образце геномной ДНК эубактерий на геле выявлена полоса следующего размера:
Bact 900 нп,
то есть было обнаружено ДНК эубактерий в лейкоцитах.

Обнаружение ДНК эубактерий в лейкоцитах ребенка свидетельствует о наличии бактериального инфицирования. Через 9 ч после поступления у ребенка появилось гнойное отделяемое из эндотрахеальной трубки, отмечалось нарастание бледности и мраморности кожных покровов, бактериологическое обследование из зева и трахеи выявило рост бактериальной микрофлоры. Произведена смена одного из антибиотиков. Вводились гипериммунные препараты плазмы и иммуноглобулина. На 4-5 сутки у ребенка наступило клиническое улучшение. Ребенок отлучен от искусственной вентиляции легких на 15-е сутки и на 23-е сутки жизни переведен для дальнейшего лечения в отделение патологии новорожденных. При переводе признаки бактериальной инфекции отсутствуют. Повторное лабораторное обследование не выявило наличие ДНК эубактерий в лейкоцитах ребенка. Таким образом, из данного примера следует, что обнаружение ДНК эубактерий в лейкоцитах свидетельствует о развитии у ребенка бактериальной инфекции и только своевременная патогенетическая терапия позволила ее купировать.

Пример 2. Ребенок В., 14-х суток жизни, история болезни 62/7108, поступил из отделения патологии новорожденных в реанимационное отделение в связи с нарастанием дыхательной недостаточности. При поступлении признаки инфицирования отсутствуют. Исследование крови по описанной выше методике показало, что в лейкоцитах крови ДНК эубактерий выявлено не было. В реанимационном отделении ребенок получал респираторную терапию. Через 24 ч и в дальнейшем в лейкоцитах крови ДНК эубактерий обнаружено не было. Трехкратное бактериологическое исследование крови и зева не обнаружило микробный рост. На 5-е сутки лечения была отменена интенсивная респираторная терапия, на 6-е сутки лечения ребенок был переведен в отделение патологии новорожденных для дальнейшего наблюдения и лечения.

Пример 3. Ребенок К. , первых суток жизни, история болезни 57/6249, доставлен в отделение реанимации на ИВЛ в связи с нарастанием дыхательной недостаточности. При поступлении в отделение ребенку было произведено исследование крови по описанной выше методике и в лейкоцитах крови было обнаружено ДНК эубактерий. В связи с этим производилась смена антибиотиков, проводилась пассивная иммунокоррекция. Клинически через 4-6 ч пребывания в отделении у ребенка отмечалось творожисто-гнойное отделяемое из эндотрахеальной трубки. На вторые сутки лечения симптомы гнойного трахеобронхита были купированы. Многопробное бактериологическое исследование крови не выявило роста микрофлоры. В последующем, на 12-е сутки лечения ДНК эубактерий в лейкоцитах обнаружены не были. Ребенок экстубирован на 15-е сутки лечения, на 21-е сутки лечения был переведен в отделение патологии новорожденных для дальнейшего наблюдения и лечения.

Предлагаемым методом было обследовано 25 новорожденных с перинатальным поражением ЦНС и респираторной патологией в возрасте 1-14 суток жизни, получавших лечение в отделении реанимации и интенсивной терапии новорожденных. У 11 детей ДНК эубактерий в лейкоцитах было обнаружено, что позволило предположить у них бактериальную инфекцию еще на доклиническом этапе заболевания. В последующем у этих новорожденных бактериальная инфекция был подтверждена клинико-бактериологически. У остальных 14 детей ДНК эубактерий в лейкоцитах обнаружено не было и у них инфекционный процесс не развился, что также подтверждено клинико-бактериологическими исследованиями. Таким образом, определение ДНК эубактерий в лейкоцитах крови у новорожденных показало, что точность заявляемого способа составляет 91,4%.

Исходя из вышеизложенного, заявляемый способ диагностики септической инфекции у новорожденных, по сравнению с существующими, имеет следующие преимущества:
1 - Способ относится к методам экспресс- диагностики (время выполнения 6 ч). Время выполнения способа - прототипа - 24 ч.

2. Предлагаемый способ обладает высокой точностью и чувствительностью и найдет широкое применение не только в отделениях реанимации, но и в других педиатрических отделениях.

3. Способ позволяет диагностировать бактериальные инфекции на доклинической стадии и осуществлять адекватную антибактериальную терапию, производя своевременную смену антибиотиков.

Предлагаемый способ позволяет врачу с первых суток жизни по наличию ДНК эубактерий в лейкоцитах крови у новорожденных оценить возможность развития септической инфекции, прогнозировать ее исход, своевременно назначить адекватную терапию, снижая число септических осложнений, преимущественно за счет сокращения наиболее тяжелых форм сепсиса, улучшая, тем самым, состояние здоровья и качество жизни детей.

Изобретение относится к области медицины, в частности к неонатологии, и найдет использование для доклинической лабораторной диагностики бактериальных инфекционных заболеваний у новорожденных. Для этого у новорожденного методом полимеразной цепной реакции с использованием диагностических праймеров, специфических к 16S rDNA- и 23S rDNA-участкам эубактерий, определяется наличие ДНК эубактерий в лейкоцитах крови, и при этом диагностируют развитие бактериального инфекционного процесса. Обнаружение в лейкоцитах крови ДНК эубакторий свидетельствует о возможности развития бактериальной инфекции, что позволяет своевременно точно, обоснованно назначать патогеническую терапию, тем самым повышая выживаемость больных и сокращая сроки лечения. 2 табл.

Способ диагностики бактериальных инфекций у новорожденных путем исследования крови, отличающийся тем, что в лейкоцитах крови определяют ДНК эубактерий и при их обнаружении диагностируют развитие бактериального инфекционного процесса.