ШТАММ BACILLUS ANTHRACIS KM90 - ОСНОВА ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНСТРУИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ АНТИГЕНОВ Российский патент 2002 года по МПК C12N1/21 A61K39/07 C12N1/20 C12N1/21 C12R1/07 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии, генетике, конструировании продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активых веществ, входящих в состав химических сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов.

Известны примеры конструирования штаммов, синтезирующих сибиреязвенные антигены, на основе бесплазмидных штаммов Bacillus anthracis. Так Barnard J. и Friedlander А. использовали в качестве основы для конструирования продуцентов протективного антигена (основного антигена, входящего в состав сибиреязвенных вакцин) бесплазмидные штаммы B. anthracis DeltaANR и B. anthracis DeltaSterne (Barnard J., Friedlander A.//Infect. Immun - 1999, - V 67. - P. 562 - 567).

Известны примеры конструирования штаммов-продуцентов сибиреязвенного протективного антигена на основе гетерогенного бесплазмидного штамма Bacillus subtilis WB600 (Baillie L. , Moir A, Manchee R.//J. Appl. Microbiol. 1998. - V. 84. - P.741 - 746, Miller J., McBride В, Manchee R, Moore P., Baillie L. //Lett. Appl. Microbiol. -1998. - V. 26. - Р.56 - 60). Особенностью штамма В. subtilis WB600 является низкая активность протеолитических ферментов, разрушающих протективный антиген на этапах выделения и очистки.

Однако перечисленные выше штаммы - основы для генетического конструирования, как и все представители рода Bacillus, являются спорообразующими. Способность сибиреязвенного микроба к образованию спор при культивировании в лабораторных или промышленных условиях требует соблюдения строгих правил безопасности работы, пренебрежение которыми может привести к обсеменению помещения и оборудования спорами B. anthracis - возбудителя опасного инфекционного заболевания, сибирской язвы. Споры - основная форма сохранения В. anthracis в объектах внешней среды. В воде они сохраняются до 18 лет, в почве - до 300 лет и более. При температуре 120-140^oС споры погибают только через 2-3 часа. Обычные обеззараживающие средства, принятые для работы с не образующими спор видами, на них не действуют. При попадании в благоприятные условия споры прорастают и образуют полноценные вегетативные клетки. Следовательно, использование в качестве основы для генетического конструирования продуцентов биологически активых веществ, в том числе сибиреязвенных антигенов, штамма В. anthracis не способного к образованию спор (аспорогенного) более целесообразно.

Известен пример клонирования гена сибиреязвенного протективного антигена в аспорогенном бесплазмидном штамме B. anthracis (Farchaus J., Ribot W., Jendrek S., Little S.//Appl. Environ Microbiol - 1998, - V. 64. -P.982 - 991).

Однако данный аспорогенный штамм обладает высокой активностью протеолитических ферментов, разрушающих синтезируемые белковые антигены. Активность протеолитических ферментов, приводящая к частичной потере выделяемого белка, является серьезной проблемой получения и очистки белковых препаратов. Для купирования разрушающего действия протеолитических ферментов на белковый препарат необходимо использование ингибиторов протеаз и специальных сред выращивания, что усложняет и удорожает процесс выделения.

Задачей изобретения является получение стабильного аспорогенного штамма B. anthracis с низкой активностью протеолитических ферментов для использования в качестве основы при конструировании продуцентов различных сибиреязвенных антигенов (антигенов клеточной стенки, протективного антигена, отечного и летального факторов, белков S-слоя) и других биологически активых веществ.

Сущность изобретения заключается в получении стабильного аспорогенного штамма-основы для конструирования продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активых веществ.

Заявляемый штамм В. anthracis КМ90 получен в результате направленного генетического конструирования, включающего несколько последовательных этапов: 1) отбор в популяции вакцинного штамма B. anthracis Sterne 34F2 спонтанного мутанта со сниженной протеолитической активностью, 2) температурная элиминация рХO1, 3) инсерционный (Тn 917) мутагенез, 4) отбор инсерционного аспорогенного мутанта.

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" (Саратов) под номером КМ90.

Основные свойства штамма B. anthracis KM90:
- аспорогенность - аспорогенность штамма дает преимущество при дальнейшем использовании сконструированных на его основе продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активых веществ, так как отсутствует вероятность обсеменения рабочих помещений, лабораторного и промышленного оборудования спорами возбудителя сибирской язвы. Aспорогенность штамма обусловлена инсерцией транспозона (Тn 917);
- авирулентность - не содержит плазмид возбудителя сибирской язвы, где располагаются структурные и регуляторные гены синтеза двух основных факторов патогенности В. anthracis - токсина и капсулы;
- низкая активность протеолитических фермеров, разрушающих белковые препараты на этапах их выделения и очистки, что обеспечивает оптимальный выход белковых сибиреязвенных антигенов и исключает необходимость применения ингибиторов протеаз;
- синтез белков S-слоя - заявляемый штамм в отличие от производственных вакцинных штаммов В. anthracis СТИ1 и В. anthracis 55 содержит в поверхностной клеточной структуре S-слой, играющий исключительную роль во взаимодействии с окружающей средой и обладающий антигенными свойствами;
- наличие резистентности к антибиотикам (эритромицину и линкамицину), обусловленной присутствием в составе генома транспозона Тn 917 (заявляемый штамм - транспозонный аспорогенный мутант);
- стабильность - сохраняет свойства при хранении, культивировании на питательных средах и в результате пассажей через организм лабораторных животных.

Морфологические признаки: грамположительные, не образующие спор палочки, капсулы не имеют.

Культуральные признаки: на твердых питательных средах клетки штамма образуют колонии с гладкой поверхностью и ровным краем (в S-форме). При выращивании в жидких питательных средах - равномерное помутнение.

Резистентность к антибиотикам: растет на питательных средах в присутствии эритромицина в концентрации 1 мкг/мл и линкамицина - 15 мкг/мл.

Биохимическая активность штамма и другие свойства: обладает низкой протеолитической и гемолитической активностями, не сорбирует конго красный, не синтезирует и не экскретирует в среду культивирования желтый пигмент. Синтезирует белки S-слоя. Оптимальная температура роста -37^oС, оптимум рН - 7,2.

Питательные потребности: является ауксотрофом, зависим в росте от метионина, треонина, фенилаланина и тиамина.

Плазмидный состав: не содержит в составе генома плазмид В. anthracis (рХО1^- рХО2^-).

Пример 1 - определение способности к спорообразованию.

Колонии с посевов, инкубировавшихся при температуре 37^oС в течение 5-ти суток на агаре Хоттингера, суспендируют в физиологическом растворе. В качестве контроля используют спорообразующий штамм В. anthracis Sterne 34F2. Пробирки с культурой помещают в водяную баню и прогревают при температуре 65^oС в течение 30 мин или при 80^oС - 10 мин. Наличие роста до прогрева и отсутствие роста после прогрева при высеве по 0,1 мл культуры на агар Хоттингера свидетельствует о неспособности клеток сибиреязвенного микроба к образованию полноценных спор.

Дополнительно способность к образованию спор проверяют при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных фуксином Циля. В качестве контроля используют спорообразующий штамм В. anthracis Sterne 34F2. В опытном мазке отмечается отсутствие характерно окрашенных спор.

Пример 2 - определение стабильности свойства аспорогенности.

Штамм несколько раз (не менее 3-х) пассируют на питательной среде (L-агар) при температуре 37^oС. После последнего пассажа делают высев на L-агар и проверяют способность к спорообразованию у 20 изолированных клонов. Отсутствие спорообразования у всех тестированных клонов свидетельствует о стабильности признака. После 3-х пассажей на питательной среде проводят 3 пассажа через организм лабораторных животных. Для этого белой мыши вводят подкожно 0,2 мл клеточной суспензии штамма в концентрации 10 млн. спор. У павшей особи делают высев из головного мозга и выделяют чистую культуру B. anthracis. Выделенной чистой культурой возбудителя сибирской язвы в той же концентрации проводят заражение следующей мыши и так повторяют всего 3 раза. Затем проверяют признак спорообразования по изложенной выше схеме. Отсутствие способности к образованию спор свидетельствует о стабильности признака.

Пример 3 - определение протеолитической активности.

Субстратами для определения активности протеолитичеких ферментов являются казеин и бычий сывороточный альбумин.

Казеиновая среда для определения протеолитической активности содержит (г/л): бакто-агар - 15,0, казеин - 2,0, трис - 1,21, K₂HPO₄ - 0,5, MnSO₄•7H₂O - 0,05, MgSO₄ - 0,2, CaCl₂ - 0,08, ZnSO₄•7H₂О - 0,005, CuSO₄•5H₂O - 0,005, (NH₄)₂SO₄ - 2,0.

Изолированные колонии с помощью петли наносят бляшкой на поверхность казеиновой среды и выращивают в термостате при 37^oС и течение 24 часов. На каждую чашку наносят не более 16 колоний. На мутном фоне среды вокруг колоний штамма с высокой активностью протеолитических ферментов образуются зоны просветления шириной до 10 мм. Зоны просветления у штамма с низкой активностью протеолитических ферментов до 1 мм.

Альбуминовая среда для определения протеолитической активности - состав, способ приготовления и применения среды указан в "Методическом пособии по генетике возбудителя сибирской язвы" - Саратов, 1991, с.28 - 30 (утверждено заместителем начальника главного эпидемического управления Минздрава СССР Онищенко Г.).

Пример 4 - определение продукции белков S-слоя.

Определение продукции белков S-слоя проводят с помощью белкового анализа. Для этого 1 петлю штамма B. anthracis KM90 засевают в жидкую питательную среду (BHI) и выращивают с аэрацией при 37^oС в течение 16 часов. Затем 20 мл культуры центрифугируют при 100000 об/мин, 4^oС, 30 мин. Отбирают супернатант, стерилизуют фильтрованием через мембранные фильтры с диаметром пор 22 мкм (Millipore) и добавляют трихлоруксусную кислоту до конечной концентрации 10%. Белок осаждают центрифугированием при 100000 об/мин, 4^oС, 30 мин. Препарат ресуспендируют в 50 мкл 0,1 М трис-НСl буферного раствора (рН - 6,7), содержащего 10% глицерина. После чего образцы вносят в лунки 7,5% полиакриламидного геля. Электрофорез проводят при силе тока 90 мА в течение 5 ч. Белок S-слоя имеет молекулярную массу 94 кДА.

Таким образом получен стабильный аспорогенный штамм B. anthracis КМ90, обладающий низкой активностью протеолитических ферментов, который рекомендуется в качестве основы для конструирования продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активых веществ - компонентов химических вакцин и диагностических препаратов.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии, иммунологии и ветеринарии. В результате направленного генетического конструирования, включающего отбор в популяции вакцинного штамма В. anthracis Sterne 34F2 спонтанного мутанта с пониженной протеолитической активностью, температурную элиминацию плазмиды рХ01, инсерционный (Тn 917) мутагенез и отбор аспорогенного мутанта, получают стабильный штамм B. anthracis КМ-90, сохраняющий свои свойства при хранении, культивировании на питательных средах и при пассажах через организм лабораторных животных. Основные свойства штамма - аспорогенность, авирулентность, низкая активность протеолитических ферментов, способность к синтезу белков S-слоя - обеспечивают возможность его применения в качестве основы для конструирования продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активных веществ, входящих в состав сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов.

Штамм Bacillus anthracis КМ90 - основа для генетического конструирования продуцентов сибиреязвенных антигенов.