ШТАММ BACILLUS ANTHRACIS KM92-ПРОДУЦЕНТ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ АНТИГЕНОВ Российский патент 2002 года по МПК C12N1/20 A61K39/07 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии, генетике, биохимии, в производстве для получения антигенов Bacillus anthracis и других биологически активных веществ, являющихся компонентами химических сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов.

Известны штаммы-продуценты сибиреязвенных антигенов, в настоящее время применяемые для производства химических вакцин и диагностических препаратов. В России - это штамм В. anthracis СТИ-1, в США - В. anthracis V770-NR-R, в Англии - В. anthracis Sterne 34F2 (Онищенко Г. с соавт. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики. - Москва, 1999). Данные штаммы не содержат плазмиды капсулопродукции, обуславливающей вирулентность штамма, но содержат плазмиду токсинообразования (рХO1), кодирующую синтез трехкомпонентного токсина. Все три составляющих сибиреязвенного токсина - протективный антиген, отечный и летальный факторы являются антигенами, из них протективный антиген - основной компонент сибиреязвенных вакцин.

Однако перечисленные выше производственные штаммы, как и все представители рода Bacillus, являются спорообразующими. Способность сибиреязвенного микроба к образованию спор при культивировании в лабораторных или промышленных условиях требует соблюдения строгих правил безопасности работы, пренебрежение которыми может привести к обсеменению помещения и оборудования спорами В. anthracis - возбудителя опасного инфекционного заболевания, сибирской язвы. Споры - основная форма сохранения В. anthracis в объектах внешней среды. В воде они сохраняются до 18 лет, в почве - до 300 лет и более. При температуре 120-140^oС споры погибают только через 2-3 часа. Обычные обеззараживающие средства, принятые для работы с необразующими спор видами, на них не действуют. При попадании в благоприятные условия споры прорастают и образуют полноценные вегетативные клетки. Следовательно, использование не способного к образованию спор (аспорогенного) штамма В. anthracis для промышленного или экспериментального выделения сибиреязвенных антигенов более целесообразно.

Известны единичные случаи выделения аспорогенных штаммов В. anthracis.

Описан аспорогенный штамм В. anthracis Davis (Uchida I., Sekizaki Т., Hashimoto K. //J. Gen. Microbiol, 1985, v.131, p.363-367).

Однако штамм В. anthracis Davis не содержит основных сибиреязвенных антигенов, входящих в состав химических вакцин и необходимых для получения большинства диагностических препаратов. В геноме В. anthracis Davis содержится плазмида капсулопродукции (рХO2), обуславливающая вирулентность штамма, но отсутствует плазмида токсинообразования (рХO1), кодирующая синтез трехкомпонентного токсина.

Известен аналогичный аспорогенный моноплазмидный капсулосодержащий штамм В. anthracis M29Spo^- (Еремин С., Никифоров А., Костюкова Т., Микшис Н. // Журн. микробиол., 1999, 4, с.91-92).

Однако данный штамм, выделенный из природного высоковирулентного штамма В. anthracis M29, также не содержит основных сибиреязвенных антигенов и, следовательно, не может быть использован в производстве сибиреязвенных вакцинных и диагностических препаратов.

Наиболее близки к заявляемому штамму В. anthracis KM92 штаммы, полученные Farchaus J. с соавторами (Farchaus J., Ribot W., Jendrek S., Little S. //Appl. Environ Microbiol, 1998, v.64, p.982-991) и Worsham P., Sowers M. (Worsham P., Sowers М. //Canadian Journal of Microbiol, 1999, v.45, p.1-8). Оба штамма являются продуцентами одного из сибиреязвенных антигенов - протективного антигена. Первый из них сконструирован на основе аспорогенного бесплазмидного штамма В. anthracis путем клонирования гена протективного антигена. Второй отобран в качестве спонтанного аспорогенного мутанта в популяции рекомбинантного бесплазмидного штамма B. anthracis с клонированным геном протективного антигена.

Однако указанные выше штаммы обладают высокой активностью протеолитических ферментов, разрушающих синтезируемые белковые антигены. Активность протеолитических ферментов, приводящая к частичной потере выделяемого белка, является серьезной проблемой получения и очистки белковых препаратов. Для купирования разрушающего действия протеолитических ферментов на белковый препарат необходимо использовать ингибиторы протеаз, что усложняет и удорожает процесс выделения.

Кроме того, клонирование одного гена, кодирующего синтез единичного антигенного продукта, сужает возможности использования рекомбинантного штамма.

Задачей изобретения является получение аспорогенного штамма В. anthracis, сохраняющего свойства при хранении и культивировании на питательных средах, обладающего низкой активностью протеолитических ферментов и являющегося продуцентом различных сибиреязвенных антигенов.

Сущность изобретения заключается в получении стабильного аспорогенного штамма-продуцента сибиреязвенных антигенов.

Заявляемый штамм возбудителя сибирской язвы получен на основе вакцинного штамма В. anthracis 55 с использованием разработанного нами способа получения аспорогенного штамма В. anthracis.

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" (Саратов) под номером КМ92.

Основные свойства штамма В. anthracis KM92:
- аспорогенность штамма дает преимущество при его использовании в качестве продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активных веществ - компонентов сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов, так как отсутствует вероятность обсеменения рабочих помещений, лабораторного и промышленного оборудования спорами возбудителя сибирской язвы;
- авирулентность подобно вакцинному штамму В. anthracis СТИ1 является моноплазмидным, т.е. не содержит плазмиды капсулопродукции;
- иммуногенность является источником сибиреязвенных антигенов:
антигенов клеточной стенки,
протективного антигена,
отечного и летального факторов;
- низкая активность протеолитических фермеров, разрушающих белковые препараты на этапах их выделения и очистки, что обеспечивает оптимальный выход белковых сибиреязвенных антигенов и исключает необходимость применения ингибиторов протеаз;
- стабильность сохраняет свойства при хранении, культивировании на питательных средах и после пассажей через организм лабораторных животных.

Морфологические признаки: грамположительные, необразующие спор палочки, капсулы не имеют.

Культуральные признаки: на твердых питательных средах клетки штамма образуют колонии с гладкой поверхностью и ровным краем (в S-форме). При выращивании в жидких питательных средах - равномерное помутнение.

Биохимическая активность штамма и другие свойства: обладает низкой гемолитической и протеолитической активностями, не сорбирует конго красный, не синтезирует и не экскретирует в среду культивирования желтый пигмент. Синтезирует сибиреязвенный токсин. Оптимальная температура роста 37^oС, оптимум рН 7,2.

Питательные потребности штамма: является ауксотрофом.

Плазмидный состав: содержит плазмиду токсинообразования (рХО1⁺ рХO2^-).

Пример 1 - определение способности к спорообразованию.

Колонии с посевов, инкубировавшихся при температуре 37^oС в течение пяти суток на агаре Хоттингера, суспендируют в физиологическом растворе. В качестве контроля используют спорообразующий штамм В. anthracis 55. Пробирки с культурой помещают в водяную баню и прогревают при температуре 65^oС в течение 30 мин или при 80^oС 10 мин. Наличие роста до прогрева и отсутствие роста после прогрева при высеве по 0,1 мл культуры на агар Хоттингера свидетельствует о неспособности клеток сибиреязвенного микроба к образованию полноценных спор.

Дополнительно способность к образованию спор проверяют при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных фуксином Циля. В качестве контроля используют спорообразующий штамм В. anthracis 55. В опытном мазке отмечается отсутствие характерно окрашенных спор.

Пример 2 - определение стабильности свойства аспорогенности.

Штамм несколько раз (не менее 3-х) пассируют на питательной среде (L-агар) при температуре 37^oС. После последнего пассажа делают высев на L-агар и проверяют способность к спорообразованию у 20 изолированных клонов. Отсутствие спорообразования у всех тестированных клонов свидетельствует о стабильности признака. После 3-х пассажей на питательной среде проводят 3 пассажа через организм лабораторных животных. Для этого белой мыши вводят подкожно 0,2 мл клеточной суспензии штамма в концентрации 10 млн спор. У павшей особи делают высев из головного мозга и выделяют чистую культуру В. anthracis. Выделенной чистой культурой возбудителя сибирской язвы в той же концентрации проводят заражение следующей мыши и так повторяют 3 раза. Затем проверяют признак спорообразования по изложенной выше схеме. Отсутствие способности к образованию спор свидетельствует о стабильности признака.

Пример 3 - определение протеолитической активности.

Субстратами для определения активности протеолитичеких ферментов являются казеин и бычий сывороточный альбумин.

Казеиновая среда для определения протеолитической активности содержит (г/л): бакто-агар - 15,0, казеин - 2,0, трис - 1,21, К₂НРO₄ - 0,5, MnSO₄•7H₂O - 0,05, MgSO₄ - 0,2, CaCl₂ - 0,08, ZnSO₄•7Н₂О - 0,005, CuSO₄•5H₂O - 0,005, (NH₄)₂SO₄ - 2,0.

Изолированные колонии с помощью петли наносят бляшкой на поверхность казеиновой среды и выращивают в термостате при 37^oС в течение 24 часов. На каждую чашку наносят не более 16 колоний. На мутном фоне среды вокруг колоний штамма с высокой активностью протеолитических ферментов образуются зоны просветления шириной до 10 мм. Зоны просветления у штамма с низкой активностью протеолитических ферментов до 1 мм.

Альбуминовая среда для определения протеолитической активности - состав, способ приготовления и применения среды указан в "Методическом пособии по генетике возбудителя сибирской язвы" - Саратов, 1991, с.28-30 (утверждено заместителем начальника главного эпидемического управления Минздрава СССР Онищенко Г.).

Таким образом, получен стабильный аспорогенный штамм В. anthracis KM92, обладающий низкой активностью протеолитических ферментов, который рекомендуется для использования при получении сибиреязвенных антигенов и других биологически активных веществ - компонентов сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии, генетике, биохимии. Аспорогенный штамм B. anthracis, сохраняющий свойства при хранении и культивировании на питательных средах, обладающий низкой активностью протеолитических ферментов, является продуцентом различных сибиреязвенных антигенов. Штамм сохраняет свойства при хранении, культивировании на питательных средах и после пассажей через организм лабораторных животных. Аспорогенность штамма дает преимущество при его использовании в качестве продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активных веществ - компонентов сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов, так как отсутствует вероятность обсеменения рабочих помещений, лабораторного и промышленного оборудования спорами возбудителя сибирской язвы. Штамм обладает низкой активностью протеолитических ферментов, разрушающих белковые препараты на этапах их выделения и очистки, что обеспечивает оптимальный выход белковых сибиреязвенных антигенов и исключает необходимость применения ингибиторов протеаз. Штамм является источником различных сибиреязвенных антигенов: антигенов клеточной стенки, протективного антигена, отечного и летального факторов.

Штамм Bacillus anthracis KM92-продуцент сибиреязвенных антигенов.