СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ Bacillus anthracis С ДИФФЕРЕНЦИАЦИЕЙ ШТАММОВ ПО ПРОДУКЦИИ КАПСУЛЫ, ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА И АНТИГЕНОВ S-СЛОЯ Российский патент 2009 года по МПК C12Q1/04 C12R1/07 G01N33/559 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, может быть использовано для идентификации штаммов B.anthracis, определения вирулентности in vitro, изучения продукции экзотоксина и антигенов S-слоя сибиреязвенного микроба, отбора иммуногенных штаммов.

Межштаммовая дифференциация имеет важное значение для идентификации возбудителя сибирской язвы, эпидемиологии и эпизоотологии в связи с тем, что микроорганизму свойственна значительная изменчивость. В то же время имеются сообщения, что сибиреязвенные штаммы, выделенные в разных регионах нашей страны и за рубежом, оказались идентичными по морфологическим, культуральным, антигенным и по основным биологическим свойствам (2, 8, 9).

Для внутривидового типирования используются культурально-морфологические, биологические, а также молекулярно-генетические методы, которые доступны для высокоспециализированных лабораторий (3).

Культурально-морфологические методы позволяют идентифицировать B.anthracis по признаку капсуло- и токсинообразования как основным факторам вирулентности. Образование капсулы на сывороточной среде с бикарбонатом в атмосфере CO₂ является одним из признаков вирулентных штаммов В anthracis. Однако использование признака капсулообразования для определения принадлежности микроорганизма к В.anthracis и оценки его вирулентности не всегда возможно. Обусловлено это тем, что непатогенные варианты В.anthracis (штаммы с атипичным капсулообразованием) образуют капсулу при выращивании как на специальных, так и на обычных питательных средах. Кроме того, образование капсулы зарегистрировано у отдельных вариантов спорообразующих бацилл (3, 4).

Для дифференциации культур сибиреязвенного микроба по вирулентности с определением признаков токсино- и капсулообразования предложена плотная питательная среда (СОПЭК), которая включает среду для токсинообразования (R-среда) и противосибиреязвенный глобулин (5). Способ позволяет дифференцировать по вирулентности культуры сибиреязвенного микроба in vitro, однако не используется для идентификации

В.anthracis в связи с тем, что противосибиреязвенный глобулин кроме антител к протективному антигену содержит антитела к другим антигенам возбудителя сибирской язвы и к антигенам различных видов спорообразующих бацилл. Наличие в противосибиреязвенном глобулине антител к широкому набору антигенов обусловлено иммунизацией лошадей клетками авирулентных штаммов B.anthracis СТИ и В.anthracis Jchtiman (фиг.1) (1). Кроме того, данный способ не позволял определять атипичные по капсулообразованию формы В.anthracis.

По данным других авторов наличие в питательной среде иммунной сибиреязвенной сыворотки задерживает рост бескапсульных токсигенных штаммов на 1-2 суток (3).

Для идентификации В.anthracis предложена сыворотка к белку, который элюировался в свободном объеме (фракция 1) при разделении культурального фильтрата В.anthracis СТИ на сверхтонком сефакриле S-300. Сыворотка позволяла идентифицировать в реакции иммунодиффузии в геле с растущими культурами микроорганизмов (РИДРК) штаммы В.anthracis независимо от содержания плазмид вирулентности (6). Из культурального фильтрата бесплазмидного штамма В.anthracis 81/1 TR гельхроматографией на сефакриле S-300 был выделен сходный по молекулярной массе с белком фракции 1 культурального фильтрата В.anthracis СТИ белок, сыворотка к которому предлагалась для изучения антигенных свойств и идентификации сибиреязвенного микроорганизма (7).

Однако оба способа не позволяли характеризовать штаммы В.anthracis по токсигенности, так как сыворотки к этим белкам не содержали антител к белкам сибиреязвенного токсина. Для этих целей могла быть использована сыворотка к фракции 5 культурального фильтрата В.anthracis СТИ, содержавшая антитела к протективному антигену, который не продуцировался на агаре Хоттингера (1).

Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является заявка на изобретение 2001115939/13, 08.06.2001 г. (Буравцева Н.П., Еременко Е.И., Лысогора Е.В. Способ идентификации B.anthracis), в которой описан способ идентификации В.anthracis, включающий посев исследуемой культуры на питательную среду, инкубирование с последующим учетом результатов роста по формированию иммунопреципитации, отличающийся тем, что посев исследуемой культуры осуществляют отдельными колониями (бляшками), в сходный по м.м. с белком фракции 1 культурального фильтрата В.anthracis СТИ в качестве питательной среды используют агар Хотгингера с 1% бикарбоната натрия и 10% инактивированной лошадиной сыворотки, культивирование проводят при 37°С при 10-20% содержания CO₂, формирование преципитации осуществляют с помощью бумажных индикаторов в виде полосок, пропитанных противосибиреязвенным глобулином жидким (коммерческим). Недостатком данного способа является то, что если идентификация штаммов В.anthracis в данном методе возможна, то дифферециация штаммов по продукции протективного антигена и антигенов S-слоя исключается в связи с содержанием в противосибиреязвенном глобулине антител к многочисленным антигенам В.anthracis, в том числе к антигенам родственных спорообразующих бацилл.

Цель изобретения - разработка способа идентификации В.anthracis с одновременной дифференциацией штаммов по продукции капсулы, протективного антигена и белков S-слоя.

Поставленная цель достигается тем, что вирулентные (типичные) сибиреязвенные штаммы на плотной питательной среде, состоящей из сердечно-мозгового агара (Difco), компонентов R-среды и 15% нормальной лошадиной сыворотки, в атмосфере с повышенным содержанием CO₂ образуют капсулу, эффективно продуцируют протективный антиген и антигены S-слоя. Для обнаружения антигенов, диффундировавших в питательный агар, используют сыворотки, полученные к белкам, которые выделяют из культуральных фильтратов после выращивания бесплазмидного штамма B.anthracis 81/1TR-продуцента белка Sap, а также токсинпродуцирующего штамма B.anthracis СТИ - продуцента белка ЕА1 и протективного антигена (ПА) на R-среде, обогащенной казаминовыми кислотами из расчета 4 г на литр, обуславливающей более высокую продукцию белков, культуральные фильтраты фракционируют на сефакриле S-300, сыворотки получают к белкам фракций 1 (белки Sap и ЕА1), которые элюируются в свободном объеме, и к белкам фракции 5 (ПА).

Способ отличается тем, что для идентификации Bacillus anthracis с дифференциацией штаммов по продукции капсулы, протективного антигена и антигенов S-слоя исследуемые микроорганизмы выращивают на R-среде с сердечно-мозговым агаром и 15% нормальной лошадиной сыворотки в течение 18 часов, в атмосфере СО₂, при 37°С, для капсулообразования, а для выявления белков S-слоя и протективного антигена в лунки агара вносят соответствующие сыворотки, вирулентные штаммы B.anthracis (Т⁺K⁺) образуют капсулу и формируют иммунопреципитаты с сыворотками к протективному антигену и антигенам S-слоя, капсулопродуцирующие штаммы B.anthracis (TK⁺) со сниженной вирулентностью образуют капсулу и формируют иммунопреципитаты только с сыворотками к антигенам S-слоя, авирулентные токсинпродуцирующие штаммы B.anthracis (Т⁺K^-) не образуют капсулу, формируют иммунопреципитаты с сыворотками к протективному антигену и антигенам S-слоя, апатогенные бесплазмидные штаммы В anthracis (T^-K^-) не образуют капсулу, формируют иммунопреципитаты только с сыворотками к антигенам S-слоя, штаммы B.anthracis с атипичным капсулообразованием и сниженной вирулентностью, растущие в виде гладких колоний на сердечно-мозговом агаре в присутствии воздуха и на сердечно-мозговом агаре с содой и нормальной лошадиной сывороткой в присутствии CO₂, формируют иммунопреципитаты с сыворотками к антигенам S-слоя, различные виды спорообразующих бацилл независимо от продукции капсулы, не формируют иммунопреципитаты с сыворотками к протективному антигену и к антигенам S-слоя.

Примеры конкретного выполнения, подтверждающие осуществление предлагаемого способа.

Получение и характеристика сывороток для предлагаемого способа

Пример 1. Штаммы-продуценты

Сибиреязвенные штаммы: токсинпродуцирующий - B.anthracis СТИ, образующий капсулу - B.anthracis Davies, бесплазмидный - B.anthracis 81/1TR отобраны как продуценты протективного антигена и белков S-слоя (10, 12, 14).

Пример 2. Получение бесклеточных культуральных фильтратов, разделение гель-хроматографией белков культуральных фильтратов, получение сывороток к отдельным белкам.

Бесклеточные культуральные фильтраты получали по ранее описанной методике (6) за тем исключением, что для более высокой продукции белков, не относящихся к токсину, в R-среду добавляли казаминовые кислоты из расчета 4 г на литр.

При фракционировании КФ штаммов B.anthracis СТИ, 81/1TR, Davies на сверхтонком сефакриле S - 300 обращало внимание наличие сходных по м.м. белков, которые элюировались в свободном объеме - фракция 1.

Для культурального фильтрата бесплазмидного штамма B.anthracis 81/1TR белок фракции 1 был доминирующим. Белки других фракций содержались в незначительном количестве и выявлялись непостоянно.

Для культурального фильтрата штамма B.anthracis Davies доминирующими были также белки фракции 1, которые элюировались в виде трех не разделившихся пиков. Кроме белков фракции 1 в культурального фильтрата B.anthracis Davies содержались белки меньшей молекулярной массы, которые в отличие от белков культурального фильтрата B.anthracis 81/1TR постоянно регистрировались в виде фракций 2, 3, 4, 6.

Особенностью культурального фильтрата токсинпродуцирующего штамма B.anthracis СТИ было наличие в нем доминирующего белка, который элюировался как фракция 5. По объему выхода маркерных белков и биологическим свойствам белок этой фракции охарактеризован как протективный антиген (фиг.2) (1).

Для получения сывороток использованы белки фракций 1, поскольку сыворотка к белку фракции 1 токсинпродуцрующего штамма B.anthracis СТИ содержала антитела к видоспецифическому антигену, а белки этих фракций были характерны для культуральных фильтратов всех трех штаммов B.anthracis независимо от содержания в штаммах плазмид вирулентности.

Пример 3. Определение принадлежности белков фракций 1 к белкам S-слоя

Электрофоретическое разделение белков показало, что культуральные фильтраты B.anthracis, 81/1TR и Davies содержали преимущественно белки с м.м. 94 кДа, характерной для белков S-слоя. По электрофоретической подвижности белки этих культуральных фильтратов оказались сходными с белком, экстрагированным из клеток B.anthracis СТИ. Культуральный фильтрат B.anthracis СТИ содержал преимущественно белок с м.м. 84 кДа, характерной для протективного антигена, а также белки м.м. 51, 41, 22 кДа, которые по-видимому являлись фрагментами протективного антигена, образовавшиеся в результате действия собственных протеаз микроорганизма (фиг.3).

В иммуноблоттинге сыворотки к белкам фракций 1 культурального фильтрата бесплазмидного и токсинпродуцирующего штаммов выявляли белки м.м. 94 кДа, характерной для белков S-слоя, которые выделены из культуральных фильтратов (белок Sap) (16) и экстрагированы из клеток (белок ЕА1) (11). Следовательно, культуральные фильтраты и экстракты клеток содержали оба белка S-слоя. По-видимому, связано это с тем, что в pXO1⁺ штаммах белок ЕА1 является основным антигеном S-слоя так, как ген atxA ген плазмиды pXO1 репрессирует ген sap. В pXO1^- и бесплазмидных штаммах репрессия гена sap исключается, что приводит к резкому увеличению продукции белка Sap (16,17).

Сыворотка к фракции 5 токсинпродуцирующего штамма выявляла белок м.м. 84 кДа, который не определялся в экстрактах клеток штаммов B.anthracis СТИ, 81/1TR, а также белки м.м. 94 кДа, которые при электрофорезе в культуральном фильтрате B.anthracis СТИ практически не определялись, что свидетельствовало о содержании в этой сыворотке антител к ПА и к белкам S-слоя (фиг.4).

Однако сыворотка к фракции 1 КФ B.anthracis СТИ в РИДРК реагировала с антигеном не идентичным антигену, выявляемому сыворотками к фракциям 1 культуральных фильтратов B.anthracis 81/1TR и Davies, а также сывороткой к фракции 3 культурального фильтрата B.anthracis СТИ, что свидетельствовало о преимущественном содержании в этих сыворотках антител к одному из антигенов S-слоя (фиг.5).

По-видимому, сыворотка к фракции 1 токсинпродуцирующего штамма содержала преимущественно антитела к белку ЕА1, сыворотка к фракции 1 бесплазмидного штамма - к белку Sap.

Известно, что продукция белков S-слоя обусловлена генами eag и sap, которые последовательно расположены на хромосоме (15, 17).

Сыворотки к белкам фракций 1 культурального фильтрата бесплазмидного и токсинпродуцирующего штаммов, изученные в РИДРК с изогенными штаммами, выявляли сибиреязвенные антигены, продукция которых не зависела от содержания в штаммах B.anthracis плазмид вирулентности, что явилось дополнительным свидетельством о содержании в сыворотках антител к белкам S-слоя (фиг.6).

Белки S-слоя являются поверхностными структурами клетки и могут одновременно находиться на ее поверхности. Поэтому специфическое окрашивание вегетативных клеток иммуноглобулинами сывороток к фракциям 1 токсинродуцирующего и бесплазмидного штаммов могут свидетельствовавать о принадлежности белков этих фракций к белкам S-слоя (фиг.7).

Пример 4. Изучение видоспецифических свойств сывороток к белкам фракций 1 бесплазмидного, токсинпродуцирующего и капсулообразующего штаммов.

При изучении видоспецифических свойств сывороток в РИДРК установлено, что сыворотки к фракциям 1 токсинпродуцирующего и бесплазмидного штаммов в отличие от сывороток к фракциям 1 B.anthracis Davies и к фракции 3 токсинпродуцирующего штаммов не реагировали с антигенами спорообразующих бацилл, что свидетельствовало об их видоспецифичности (фиг.5, 6, 12).

В иммуноблотинге сыворотки к фракциям 1 токсинпродуцирующего и бесплазмидного штаммов не реагировали с экстрагированными из вегетативных клеток белками м.м. 94 кДа В. cereus VRRL569 и более 97 кДа B.thuringiensis v. Pasteur, что подтвердило видоспецифичность сывороток (фиг.8).

Следовательно, сыворотка к фракции 1 бесплазмидного штамма, как и сыворотка к фракции 1 токсинпродуцирующего содержали антитела преимущественно к одному из антигенов S-слоя и могли быть использованы для идентификации сибиреязвенных штаммов в РИДРК.

Осуществление способа по определению принадлежности микроорганизмов к виду В.anthracis и дифференциации сибиреязвенных штаммов по продукции капсулы, протективного антигена и антигенов S-слоя

Пример 5. Приготовление питательной среды для продукции капсулы, антигенов S-слоя и протективного антигена

В качестве питательной среды использовали плотную питательную среду, которую получали смешиванием равных объемов с двойной концентрацией сердечно-мозгового агара («Difco») и компонентов R-среды с нормальной лошадиной сывороткой (15%), инактивированной при 56°С в течение 30 мин. Бактериологические чашки устанавливали на горизонтальную поверхность, в которые вносили по 17 мл питательной среды. Чашки с сухой поверхностью застывшего агара использовали для постановки РИДРК.

Пример 6. Посев исследуемых штаммов и условия культивирования

На агар в чашках засевают типичный токсинпродуцирующий штамм в виде газона 10×50 мм, против которого на расстоянии 20 мм засевают исследуемый штамм. Кроме того, на свободной площади агара засевают отдельно оба штамма для получения роста в виде изолированных колоний. Чашки с посевами помещают в эксикатор с горящей свечой и закрывают крышкой. После затухания свечи эксикатор с чашками помещают в термостат с температурой 37°С на 18-20 часов.

Пример 7. Учет роста микроорганизмов на агаре и внесение сывороток

Через 18-20 ч учитывают продукцию штаммами капсулы. Для подтверждения капсулообразования из газонов выросших культур готовят мазки, которые окрашивают раствором по Ребигеру. При микроскопии мазков капсула имеет розовый цвет, тело клетки - фиолетовое.

Между газонами сибиреязвенного и исследуемого штаммов в агаре пробивают лунки диаметром 5 мм с расстоянием между центрами лунок 10 мм. Удаляют агар из лунок, в которые последовательно вносят сыворотки к фракции 1 бесплазмидного (анти-Sap), к фракции 5 (анти-ПА) и к фракции 1 токсинпродуцирующего штамма (анти-ЕА1). Чашки устанавливают на горизонтальную поверхность и выдерживают 18-20 ч.

Пример 8. Сроки учета образования иммунопреципитатов и регистрация результатов

Через 18-20 ч чашки просматривают в темной комнате на черном фоне в косопроходящем свете при наличии иммунопреципитатов фотографируют.При отсутствии иммунопреципитатов чашки переворачиват вверх дном, в крышки вносят до 1,5 мл формальдегида и оставляют на 24-48 ч, поле чего газоны смывают, образование иммунопреципитатов учитывают повторно, фотографируют.

Примеры учета РИДРК по идентификациии и межштаммовой дифференциации B.anthracis отражены на фиг.9-12.

Из чертежей следует:

- вирулентные штаммы B.anthracis (T⁺K⁺) образовали иммунопреципитаты с сыворотками к протективному антигену и антигенам S-слоя, они формировали капсулу только в атмосфере с повышенным содержанием CO₂;

- авирулентные токсинпродуцирующие штаммы (B.anthracis (Т⁺K^-) образовали иммунопреципитаты с сыворотками к протективному антигену и антигенам S-слоя, капсулу не формировали;

- со сниженной вирулентностью капсулообразующие штаммы B.anthracis (T^-K⁺) образовали иммунопреципитаты только с сыворотками к антигенам S-слоя и формировали капсулу в атмосфере с повышенным содержанием CO₂;

- со сниженной вирулентностью и атипичным капсулообразованием штаммы B.anthracis(TK⁺) вырастали в виде гладких колоний, формировали иммунопреципитаты с сыворотками к антигенам S-слоя;

- штаммы различных видов спорообразующих бацилл не продуцировали капсулу и не формировали иммунопреципитаты с сыворотками к протективному антигену и к антигенам S-слоя.

Результаты определения видовой принадлежности и внутривидовой дифференциации исследуемых штаммов по продукции капсулы, протективного антигена, антигенов S - слоя обобщены в таблице.

Данные таблицы свидетельствуют, что штаммы, образующие капсулу, продуцирующие протективный антиген и антигены S-слоя, обуславливающие гибель морских свинок при введении 50-70 спор, являются вирулентными штаммами B.anthracis.

Штаммы, которые не образовывали капсулу, но продуцировали протективный антиген и антигены S-слоя, не вызывали гибели животных при введении 2×10⁶-1×10⁷ спор, являются авирулентными токсинпродуцирующими штаммами B.anthracis.

Штаммы, которые образовывали капсулу, продуцировали антигены S-слоя и не продуцировали протективный антиген, не вызывали гибель животных при введении 2,6×10⁴ спор, отнесены к образующим капсулу штаммам B.anthracis со сниженной вирулентностью.

Штаммы, не образующие капсулу, которые продуцировали только антигены S-слоя, не вызывали гибель животных при введении 5×10⁶ и более спор, являются апатогенными бесплазмидными штаммами В.anthracis.

Штаммы других видов спорообразующих бацилл не образовывали капсулу, не продуцировали антигены S-слоя и протективный антиген, вирулентность этих штаммов для животных не определяли.

Таким образом, использование сывороток к белкам S-слоя и к протективному антигену для обнаружения в РИДРК антигенов, диффундирующих в питательный агар, позволяет одновременно определять принадлежность микроорганизмов к B.anthracis, дифференцировать штаммы по продукции капсулы, протективного антигена и антигенам S-слоя и судить о вирулентности штаммов.

Возбудитель сибирской язвы имеет две резидентные плазмиды: плазмиду капсулообразования - pXO2, токсинообразования - pXO1, которые могут элиминироваться под воздействием различных факторов, что приводит к изменению морфологических, биологических и антигенных свойств штаммов В.anthracis.

Известно, что белки S-слоя этого микроорганизма кодируются хромосомными генами, поэтому продукция белков S-слоя является наиболее стабильным признаком В.anthracis. Диагностические сыворотки к этим антигенам характеризуются видоспецифичностью, что позволяет идентифицировать штаммы В.anthracis с различным содержанием плазмид вирулентности.

Естественно, что с помощью сывороток к белкам S-слоя невозможно определить продукцию штаммами В.anthracis протективного антигена, как и использование сывороток к протгивному антигену не позволит определить бесплазмидные и одноплазмидные капсулообразующие штаммы.

Белки S-слоя могут продуцироваться на обычных питательных средах (мясо-пептонный агар, агар Хоттингера, сердечно-мозговой агар, Л-агар). Для продукции штаммами В.anthracis капсулы необходимо в наличие этих питательных средах бикарбоната натрия, нормальной лошадиной сыворотки и атмосферы с повышенным содержаниам СО₂. Средой для продукции протективного антигена является R-среда (Ristroph J.D., ivins В. Elaboration of Bacillus anthracis antigens in new, defined culture medium. Inf. Immun. - 1983. - V.39, №1. - P.483-486).

Для выделения белков из культуральных фильтратов нами была использована жидкая R-среда, обогащенная казаминовыми кислотами, обуславливающая более высокий выход белков S-слоя и протективного антигена, а для определения антигенов, продуцируемых в питательный агар В.anthracis - R-среда с сердечно-мозговым агаром, бикарбонатом натрия, нормальной лошадиной сывороткой, которая кроме продукции белков S-слоя и протективного антигена обуславливала капсулообразование.

Таким образом, использование плотной питательной среды, обуславливющей продукцию штаммами В.anthracis белков S-слоя, протективного антигена, а также капсулообразование и сывороток, содержащих антитела к отдельным белкам S-слоя и к протективному антигену, позволило надежно не только идентифицировать штаммы В.anthracis с различным профилем плазмид вирулентности, а также дифференцировать эти штаммы по продкуции белков S-слоя, протективного антигена и по капсулообразованию. По этим признакам оказалось возможным судить о вирулентности исследуемых штаммов.

Таблица
Результаты идентификации и межштаммовой дифференциации В.anthracis № Штаммы Капсула Антигены S-слоя Протектив-
ный антиген Оценка патогенности in vitro Заражение морских свинок Оценка патогенности in vivo 1. В.anthracis СТИ - + + авирулентный выж. от 5×10⁶ с авирулентный 2. В.anthracis 55 - + + авирулентный выж. от 1×10⁷ с авирулентный 3. В.anthracis Sterne - + + авирулентный выж. от 1×10⁶ с авирулентный 4. В.anthracis 81/1 + + + вирулентный пали от 25 с вирулентный 5. B.anthracis 81/1R - + + авирулентный выж. от 2×10⁶ с авирулентный 6. В.anthracis 81/1 TR - + - апатогенный выж. от 2×10⁷ с апатогенный 7. В.anthracis 44/1CO + + + вирулентный пали от 67 с вирулентный 8. B.anthracis 44/1COR - + + авирулентный выж. от 3×10⁵ с авирулентный 9. B.anthracis 44/1CO TR - + - апатогенный выж. от 1×10⁷ с апатогенный 10. B.anthracis 591/2 + + + вирулентный пали от 80 с вирулентный 11. B.anthracis 591/2 R - + + авирулентный выж. от 1×10⁵ c авирулентный 12. B.anthracis 591/2 TR - + ' - апатогенный выж. от 1×10⁵с апатогенный 13. B.anthracis 619/42 + + + вирулентный пали от 50 с вирулентный 14. B.anthracis 619/42 R - + + авирулентный выж. от 1×10⁶ с авирулентный 15. B.anthracis 619/42 TR - + - апатогенный выж. от 1×10⁷ с апатогенный 16. B.anthracis Davies Δ - + - апатогенный выж. от 6×10⁵ апатогенный 17. B.anthracis Davies S* + + - снижен, вирулентн. пали от 5×10⁵ с снижен, вирулентн. 18. B.anthracis 12/16 ± + - снижен, вирулентн. пали от 2,6×10⁴ с сниж.вирулентн. 19. B.anthracis 2-7 + + + вирулентный пали от 60 с вирулентный 20. B.anthracis 1** + + + вирулентный пали от 70 с вирулентный 21. B.anthracis 19** + + + вирулентный пали от 50 с вирулентный 22. B.anthracis 22** + + + вирулентный пали от 60 с вирулентный                 23. B.cereus NBBL569 - - -       24. В.cereus ATCC 6464 - - -       25. B.mycoides 2 - - -       26. B.mesentericus 6 - - -       27. B.subtilis 6051 - - -       28. B.subtilis BD 430 - - -       29. B.megaterium 1 - - -       30. B.megaterium 216 - - -       31. B.thuringiensis var. Galleria - - -       32. B.thuringiensis var. Pasteuer - - -       Штаммы: B.anthracis СТИ, Sterne, 55 (все ПА⁺К^-), 81/1, 44/1СО, 591/2, 619/42, 2-7 (все ПА⁺К⁺), 12/16 (ПА^- К⁺), В.anthracis Davies Δ (ПА^- К^-), * Davies S (ПА^- К⁺) - вариант атипичный по капсулообразованию; B.cereus VRRL 569, АТСС 6464, В.mycoides 2, B.mesentericus 6, В.subtilis 6051, BD 430, В.megaterium 1, 216, В.thuringiensis v.Galleria et v.Pasteur - получены из коллекционного центра патогенных микроорганизмов ВолгНИПЧИ. Штаммы: B.anthracis 81/1R, 619/42R, 44/1COR, 591/2R (все ПА⁺К^-), 619/42TR, 81/1TR, 44/1COTR, 591/2TR (все ПА^- К^-) - получены авторами путем температурной элиминации плазмид вирулентности (12). ** Штаммы B.anthracis 1, 19, 22 выделены из почвы места забоя больных животных, принадлежность к B.anthracis подтверждена в пробе с фагами К и Гамма, а также в тесте жемчужного ожерелья. Обозначения: + - наличие признака - - отсутствие признака.

Литература

1. Баркова И.А., Липницкий А.В., Барков A.M., Евтеева Е.В. Использование иммуноглобулинов к отдельным внеклеточным антигенам Bacillus anthracis СТИ для идентификации сибиреязвенного микроба. // Биотехнология, - 2005. - №2. - С.91-95).

2. Бойков Ю.И. // Сб.науч.тр. ВНИИВС «Проблемы ветеринарной санитарии» - М., 1964. - Т.24. - С.86-88.

3. Маринин Л.И., Онищенко Г.Г., Степанов А.В. и др. Оценка значимости некоторых методов видовой идентификации возбудителя сибирской язвы. // Микробиологическая диагностика сибирской язвы. ВУНМЦ МЗ РФ, М., 1999. С.221).

4. Найманов П.И. Особенности питания и биологическая характеристика Bacillus anthracis. Дисс.канд. мед. наук. - Иркутск, 1987.

5. Пат. России №2092550, МПК C12N 1/20, C12Q 1/04. Среда для сочетанного определения продукции экзотоксина и капсулы/ Еременко Е.И. /; заявл. 15.04.1994; опубл. 10.10.1997, Бюл. №6.

6. Пат. России №2191603, МПК 7 A61K 39/40, 39/07, G01N 33/53, 33/351. Способ получения сыворотки для идентификации возбудителя сибирской язвы / Барков A.M., Липницкий А.В., Евтеева Е.В. /; заявл. 29.06.01; опубл. 27.10.02, Бюл. №5.

7. Пат. России №2230570, МПК 7 A61K 39/07, 35/74. Способ выделения высокомолекулярного соматического сибиреязвенного антигена / Ермакова И.А., Липницкий А.В., Барков A.M., Евтеева Е.В. /; заявл. 04.11.02.; опубл. 20.06.04, Бюл. №14.

8. Соркин Ю.И. // Матер. VIII пленар. засед. межведомственной комиссии по борьбе с сибирской язвой «Актуальные вопросы профилактики сибирской язвы в СССР». М., 1971. - С.123-125).

9. Цыганкова О.И. Фенотипическая и генетическая вариабельность штаммов сибиреязвенного микроба (теоретические и практические аспекты). Дис.докт. мед. наук. - Ставрополь, 2007. - 372 с.

10. Chitlaru Т., Gat О., Gozlan Y., Shafferman A. Differential Proteomic Analysis of the Bacillus anthracis Secretove: Distinct Plasmid and Chromosome CO₂-Dependid Cross Talk Mechanisms Modulate Extracellular Proteolytic Activities // J. Bacteriol. - 2006. - Vol.188. - No.10. - P.3551 - 3571.

11. Ezzel J., Abshire T. Immunological analysis of cell associated antigens of Bacillus athracis // Infect. Jmmun. - 1988. - Vol.56. - P.349-356.

12. Farchaus J.B., Ribot W.J., Downs M., Ezzel J.W. Purification and Charaterization of the major surface array protein from the avirulent Bacillus anthracis Delta Sterne-1 // J. Bacterid. - 1995.- Vol.177. - 9. - P.2481-2489.

13. Green B.D., Laurie Battisti, Kochler T.M. et al. Demonstration of capsule in B.anthracis // Inf. Immun. - 1985. - v.49, №2. - P.291-297.

14. Lamonica J.M., Wagner M.A., Echenbrenner M. Comparative secretome analyses of the Bacillus anthracis strains with variant plasmid contents. // Infect. Jmmun. - 2005. - Vol.73. - No.6. - P.3646-3658)

15. Mesnage S., Tosi-Couture E., Gounon P., Fouet A. The capsule and S-layers: two independent and yet compatible macromolecular structures in Bacillus anthracis // J. Bacteriol. - 1998. - V.180. - N 1. - P.52-58; Mignot Т., Mock M., Fouet A.A plasmid - encoded regulator couples the synthesis of toxin and surface structures in bacillus anthracis // Mol. Microbiol. - 2003. - V.47. - №4. - P.917 - 927.

16. Mignot Т., Mesnage S., Counture-Tosi E., et al. Developmental switch of S-layer protein syntesis in Bacillus anthracis. // Mol. Microbiol. - 2002. - Vol.43. - P.1615-1628;

17. Mignot Т., Mock M., Fouet A.A plasmid - encoded regulator couples the synthesis of toxin and surface structures in bacillus anthracis // Mol. Microbiol. - 2003. - V.47. - №4. - P.917-927).

Изобретение относится к микробиологии. Вирулентные сибиреязвенные штаммы выращивают на плотной питательной среде. Антигены S-слоя диффундируют в питательный агар и выявляются соответствующими сыворотками по образованию линий иммунопреципитации. Капсула определяется визуально по морфологии колоний и с помощью световой микроскопии мазков, окрашенных по Ребигеру. При этом в способе используются бесплазмидый штамм В.anthracis 81/1TR и токсинпродуцирующий штамм В.anthracis СТИ. Таким образом, разработанный способ является доступным методом, значительно упрощает общепринятую схему идентификации возбудителя сибирской язвы и сокращает сроки проведения анализа. 1 з.п. ф-лы, 12 ил., 1 табл.

1. Способ идентификации Bacillus anthracis с дифференциацией штаммов по продукции капсулы, протективного антигена и антигенов S - слоя, включающий постановку реакции иммунодиффузии в геле с антигенами растущих культур (РИДРК) с последующим учетом результатов, отличающийся тем, что для более высокого выхода белков S-слоя, характерных для различных генотипов В. anthracis, бесплазмидый штамм В.anthracis 81/1TR и токсинпродуцирующий штамм В.anthracis СТИ выращивают на R-среде, обогащенной казаминовыми кислотами из расчета 4 г/л, после чего культуральные фильтраты фракционируют на сефакриле S-300, отбирают белки, которые элюируются в свободном объеме при фракционировании культуральных фильтратов штаммов В.anthracis 81/1TR и СТИ (фракции 1, белки S-слоя м.м. 94 кДа), а также белки фракции 5 культурального фильтрата В.anthracis СТИ (протективный антиген м.м. 84 кДа), к которым получают диагностические сыворотки, используемые в последующем для идентификации различных вариантов В. anthracis.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для идентификации В.anthracis с дифференциацией штаммов по продукции капсулы, протективного антигена и белков S-слоя, исследуемые микроорганизмы засевают в виде прямоугольного газона на R-среду с сердечно-мозговым агаром и 15% нормальной лошадиной сыворотки, микроорганизмы выращивают в течение 18 ч, в атмосфере с повышенным содержанием СO₂, при 37°С - в условиях для оптимальной продукции В.anthracis капсулы, белков S-слоя и протективного антигена, для выявления которых в лунки, пробитые против газона выросших микроорганизмов, вносят диагностические сыворотки, принадлежность микроорганизма к В.anthracis определяют по следующим признакам:
вирулентные штаммы В.anthracis (T⁺K⁺) образуют капсулу, формируют иммунопреципитаты с сыворотками к протективному антигену и к обоим антигенам S-слоя;
авирулентные капсулопродуцирующие штаммы В.anthracis (T^-K⁺) образуют капсулу, формируют иммунопреципитаты только с сыворотками к антигенам S-слоя;
авирулентные токсинпродуцирующие штаммы В.anthracis (T⁺K^-) капсулу не образуют, формируют иммунопреципитаты с сыворотками к протективному антигену и антигенам S-слоя;
авирулентные бесплазмидные штаммы В.anthracis (Т^-K^-) капсулу не образуют, формируют иммунопреципитаты только с сыворотками к антигенам S-слоя;
авирулентные с атапичным капсулообразованием штаммы В. anthracis, растущие в виде гладких колоний на сердечно-мозговом агаре в присутствии воздуха и на сердечно-мозговом агаре с бикарбонатом натрия и нормальной лошадиной сывороткой в присутствии СО₂, формируют иммунопреципитаты с сыворотками к антигенам S-слоя.