СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АСПОРОГЕННОГО ШТАММА BACILLUS ANTHRACIS (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2002 года по МПК C12N1/20 C12N1/21 C12N1/20 C12R1/07 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии, генетике, для получения и генетическою конструирования штаммов сибиреязвенного микроба - продуцентов биологически активных веществ.

Известен метод случайного отбора аспорогенных штаммов возбудителя сибирской язвы - микроорганизма, относящегося к спорообразующему виду Bacillus. Спорообразование является функциональным признаком, поэтому прямой отбор клонов с его нарушением чрезвычайно затруднен. Случаи выделения аспорогенных культур в популяциях исходных спорообразующих штаммов Bacillus anthracis методом случайного отбора имеют единичный характер. Выделен аспорогенный моноплазмидный капсулосодержащий штамм В. anthracis Davis (Uchida I. , Sekizaki Т., Hashimoto К. // J. Gen. Microbiol. - 1985. - V. 131. - P. 363-367). Выделен аналогичный аспорогенный штамм В. anthracis M29Spo^- (Еремин С. , Никифоров А. , Костюкова Т., Микшис Н. // Журн. микробиол. - 1999. - 4 - С. 91-92). Выделен аспорогенный бесплазмидный штамм В. anthracis, используемый для конструирования продуцента сибиреязвенного протективного антигена (Farchaus J., Ribot W., Jendrek S., Little S. // Appl. Environ Microbiol. - 1998 - V. 64. P. 982-991).

Однако процедура рутинного отбора сводится к случайному выбору среди огромного количества клонов. Она продолжительна по времени, требует больших материальных затрат и малоэффективна.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ, заключающийся в использовании для отбора клона с нарушенной функцией спорообразования признака пигментсорбции (Worsham Р., Sowers М. // Canadian Journal of Microbiol. - 1999. - V 45. - Р. 1-8). Авторы обнаружили закономерность, согласно которой спонтанно образующиеся аспорогенные клоны В. anthracis отличаются по способности к сорбции пигмента конго красного. Способ заключается в высеве до изолированных колоний культуры штамма В. anthracis delta Sterne-1(рРА102) на твердую питательную среду с добавлением конго красного, инкубации и отборе отличающихся по способности к сорбции пигмента колоний с последующим тестированием у них признака спорообразования.

Однако описанный выше способ получения аспорогенного штамма пригоден только для отдельных штаммов В. anthracis, многократно пересевавшихся в лабораторных условиях и характеризующихся гетерогенностью популяционного состава.

Задачей изобретения является разработка эффективного способа, позволяющего получать аспорогенные штаммы В. anthracis на основе широкого диапазона культур сибиреязвенного микроба.

Поставленная задача решается двумя вариантами.

По первому варианту сущность заявляемого способа заключается в следующем: способ получения аспорогенного штамма, включающий высев культуры на питательную среду до получения изолированных колоний, инкубацию и отбор атипичных колоний с последующим тестированием у них способности к образованию спор, а также проведение перед высевом культуры неоднократного пассирования до накопления в популяции спонтанных аспорогенных клонов и осуществление отбора колоний по атипичной морфологии (в S-форме).

Кроме того, сущность изобретения заключается во введении дополнительной операции, когда отобранные колонии с атипичной морфологией в S-форме засевают в питательный бульон и отбирают клоны, отличающиеся по характеру роста в жидкой питательной среде; в проведении пассирования перед высевом до появления значимого количества (10 - 30%) атипичных колоний и усовершенствовании режимов инкубации (в течение 24-48 часов в термостате при 37^oС, затем при комнатной температуре еще 24-48 часов до появления ярко выраженных различий в морфологии колоний).

Предлагаются модификации отбора: 1) по морфологии колонии, 2) по морфологии колоний и пигментсорбции. Для этого в качестве среды для высева культуры используют L-aгaр или L-aгap с добавлением конго красного соответственно.

По второму варианту сущность заявляемого способа заключается в следующем: способ получения аспорогенного штамма, включающий высев культуры на питательную среду до получения изолированных колоний, инкубацию и отбор античных колоний с последующим тестированием у них способности к образованию спор, а также осуществление перед высевом культуры транспозонного мутагенеза для получения аспорогенных клонов.

Кроме того, сущность изобретения по второму варианту заключается во введении транспозона (Тn917) в составе векторной плазмиды pLTV3ts в клетки бесплазмидного штамма В. anthracis методом трансдукции и выключении признака спорообразования путем встраивания транспозона в последовательность хромосомных генов с одновременной температурной элиминацией векторной плазмиды.

Первый вариант способа получения аспорогенного штамма В. anthracis осуществляется следующим образом.

Штамм B. anthracis несколько раз пассируют на питательной среде до накопления в популяции клонов с нарушенным признаком спорообразования.

Для этого одну петлю споровой культуры любого штамма В. anthracis засевают во флакон с 25 мл бульона Хоттингера.

Инкубируют с аэрацией на шюттель-аппарате (80 вращ./мин) при температуре 37^oС от 3 до 18 часов.

После периода инкубации 2,5 мл выросшей культуры переносят во флакон с 25 мл стерильной среды и продолжают инкубацию в тех же условиях.

Таким образом повторяют четыре и более раз. Количество пассажей считают достаточным, если при высеве 0,1 мл культуры на чашку с L-агаром образуется 10 - 30% атипичных по морфологии колоний.

После последнего пассажа штамма B. anthracis делают высев до получения изолированных колоний на твердую питательную среду (L-агар или L-агар с добавлением конго красного).

Инкубируют в термостате при 37^oС в течение 24-48 часов, затем при комнатной температуре еще 24-48 часов до появления ярко выраженных различий в морфологии колоний.

Выросшие колонии просматривают в отраженном свете и отбор осуществляют по морфологии колонии или по признаку пигментсорбции.

Клоны в S-форме тестируют на способность к споруляции.

Для этого колонии с посевов, инкубировавшихся от 2-х до 5-ти суток (время, необходимое для образования спор), суспендируют в 1-2 мл физиологического раствора.

Пробирки с культурой помещают в водяную баню и прогревают при температуре 65^oС в течение 30 минут или при 80^oС - 10 минут.

После прогрева делают высев по 0,1 мл из каждой пробирки на твердую питательную среду (агар Хоттингера или любая среда для выращивания сибиреязвенного микроба).

Посевы инкубируют в термостате при 37^oС 48 часов и в случае отсутствия роста выдерживают еще 5 суток для контроля. Отсутствие роста на питательной среде после прогрева свидетельствует о нарушении признака спорообразования. В качестве контроля используют исходный спорообразующий штамм В. anthracis.

Дополнительно способность к образованию спор проверяют при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных фуксином Циля. В мазке аспорогенного штамма отсутствуют характерно окрашенные споры.

Предлагаемый первый вариант способа получения аспорогенного штамма В. anthracis имеет несколько модификаций отбора.

1. После неоднократного пассирования культуру высевают на L-aгap и отбор проводят по морфологии колоний. Отбирают среди плотных и шероховатых колоний (в R-форме) более прозрачные и гладкие, с блестящей поверхностью (в S-форме).

2. После неоднократного пассирования культуру высевают на L-aгap с добавлением конго красного. Конго красный добавляют в растопленный и остуженный до 45^oС L-aгap в виде стерилизованного фильтрованием водного раствора до конечной концентрации в среде 25 мкг/мл. Отбор проводят одновременно по двум признакам: морфологии колоний и пигментсорбции. Среди бледно-розовых, розовых, красноватых колоний в R-форме отбирают колонии ярко-красные в S-фopме.

В некоторых случаях отобранные на вышеперечисленных средах атипичные колонии дополнительно тестируют на характер роста в жидкой питательной среде. По одной петле культуры с колоний в S-форме засевают в питательный бульон, разлитый по 2 - 5 мл в пробирки. Инкубируют без аэрации в термостате при 37^oС. Учет результатов осуществляют через 48 часов. Отбирают клоны, образующие при росте равномерное помутнение среды (обычно сибиреязвенный микроб в жидкой питательной среде растет в виде придонного осадка).

Второй вариант способа получения аспорогенного штамма осуществляется следующим образом.

Транспозон (Тn917) в составе векторной плазмиды pLTV3ts вводят в клетки бесплазмидного штамма В. anthracis методом трансдукции с использованием фага CP51ts45.

Для этого одну петлю культуры реципиентного бесплазмидного штамма В. anthracis засевают во флакон с жидкой питательной средой. Инкубируют с аэрацией на шюттель-аппарате (80 вращ./мин) при температуре 37^oС 18 часов.

Выросшую культуру разводят в 10 раз стерильной средой и продолжают инкубацию в тех же условиях в течение 6-7 часов.

Затем 0,5 мл клеточной суспензии смешивают с 0,5 мл фага, размноженного на донорной культуре, и наносят трансдукционную смесь на мембранный фильтр (0,22 мкм, "Millipore"), расположенный на пластинке L-агара с субселективной концентрацией эритромицина (0,1 мкг/мл). Инкубируют в термостате 4 часа при 30^oС.

Через 4 часа фильтр переносят на пластинку L-агара с селективными концентрациями эритромицина (1 мкг/мл), линкамицина (25 мкг/мл) и тетрациклина (10 мкг/мл) и продолжают инкубацию до 36 - 48 часов при температуре 30^oС.

Полученные трансдуктанты трижды пересевают на твердой питательной среде с добавлением антибиотиков для предупреждения вторичного инфицирования фагом и контроля над стабильностью наследования маркеров векторной плазмиды (тетрациклина) и транспозона (эритромицина и линкамицина).

Наличие в клетках трансдуктантов транспозонсодержащего вектора подтверждают данными электрофоретического анализа.

На следующем этапе осуществляют элиминацию векторной плазмиды pLTV3ts с одновременным встраиванием транспозона в последовательность хромосомных генов.

Для этого одну петлю культуры стабильного трансдуктанта, получившего в результате генетического переноса плазмиду pLTV3ts, засевают в 25 мл жидкой питательной среды с добавлением тетрациклина в селективной концентрации (10 мкг/мл) и эритромицина в субселективной концентрации (0,1 мкг/мл).

Инкубируют на шюттель-аппарате (80 вращ./мин) при 30^oС в течение 16-20 часов.

Переносят 1 мл культуры в 25 мл стерильной среды с добавлением эритромицина и линкамицина в селективных концентрациях (1 и 10 мкг/мл соответственно). Инкубируют при 43^oС.

Таким образом повторяют 4 раза. Первые 2 раза инкубацию осуществляют на шюттель-аппарате (80 вращ. /мин) по 4 часа, последние - в термостате по 18 часов.

После четвертого пассажа 1 мл культуры засевают в 25 мл жидкой питательной среды без антибиотиков и выращивают в течение суток при 30^oС.

Эффективность температурной элиминации плазмиды pLTV3ts и транспозиции Тn917 в хромосому определяют по фенотипическому выражению чувствительности к тетрациклину и резистентности к эритромицину и линкамицину и подтверждают данными электрофоретического анализа.

Полученная клеточная суспензия представляет собой депо транспозантов со случайными вставками транспозона в последовательность хромосомных генов.

Вслед за транспозицией (в сроки не более 1 месяца) проводят отбор аспорогенных транспозонных мутантов по морфологии колонии и пигментсорбции.

Для этого из клеточного депо транспозантов осуществляют высев до изолированных колоний на твердую питательную среду (L-агар или L-агар с добавлением конго красного).

Посевы инкубируют в термостате при 37^oС в течение 24 - 48 часов, затем при комнатной температуре еще 24 - 48 часов до появления ярко выраженных различий в морфологии колоний.

Выросшие колонии просматривают в отраженном свете и отбор осуществляют по морфологии колонии или по признаку пигментсорбции.

Клоны, отличающиеся по морфологии колоний и сорбции пигмента, тестируют на способность к споруляции по методике, описанной в варианте 1.

Возможность практического применения изобретения иллюстрируется примерами.

Пример 1 (вариант 1) - получение аспорогенного штамма В. anthracis KM89.

Для накопления спонтанных мутантов в популяции штамма В. anthracis Sterne 34F2 одну петлю споровой культуры засевают в 25 мл питательного L-бульона и пассируют 4 раза по 3 часа с аэрацией при температуре 37^oС.

Затем делают высев до изолированных колоний на L-агар.

Чашки с посевами инкубируют в термостате при 37^oС в течение 48 часов, а затем при комнатной - 24 часа.

Выросшие колонии просматривают в отраженном свете и отбирают среди шероховатых и плотных колоний (в R-форме) более прозрачные и гладкие с блестящей поверхностью (в S-форме).

Отобранные клоны, отличающиеся по морфологии, тестируют на способность к споруляции.

Для этого колонии с посевов, инкубировавшихся 48 часов, суспендируют в 2 мл физиологического раствора. Пробирки с культурой помещают в водяную баню и прогревают при температуре 65^oС в течение 30 минут. Затем делают высев по 0,1 мл на чашки с L-агаром. Отсутствие роста после прогрева свидетельствует о нарушении признака спорообразования.

В качестве контроля используют спорообразующий штамм В. anthracis Sterne 34F2. Дополнительно способность к образованию спор проверяют при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных фуксином Циля. В опытном мазке отмечается отсутствие характерно окрашенных спор.

Пример 2 (вариант 2) - получение аспорогенного штамма B. anthracis KM90.

Реципиентные клетки штамма B. anthracis SterneΔT выращивают при 37^oС в L-бульоне в течение 18 часов, после чего суспензию разводят в 10 раз стерильной средой и продолжают инкубацию в тех же условиях в течение 6 часов.

После периода инкубации 0,5 мл клеточной суспензии смешивают с 0,5 мл фага, размноженного на донорной культуре. Трансдукционную смесь наносят на мембранный фильтр, расположенный на пластинке L-агара с субселективной концентрацией эритромицина (0,1 мкг/мл).

Инкубируют 4 часа при 30^oС. Затем фильтр переносят на пластинку L-агара с селективными концентрациями эритромицина и линкамицина и продолжают инкубацию до 48 часов при температуре 30^oС.

Выросшие резистентные к эритромицину и линкамицину колонии переносят на питательную среду, содержащую тетрациклин, эритромиции и линкамицин. Отбирают клоны, растущие на трех антибиотиках, после чего определяют плазмидные профили.

Фенотипическое выражение резистентности к указанным выше трем антибиотикам и присутствие на электрофореграмме зоны ДНК, соответствующей по подвижности ДНК плазмиды pLTV3ts, свидетельствуют о наличии в клетках трансдуктантов транспозонсодержащего вектора.

Трансдуктант засевают в 25 мл питательного бульона с добавлением тетрациклина в селективной и эритромицина в субселективной, индуцирующей транспозицию, концентрациях.

Выращивают на шюттель-аппарате (80 вращ./мин) при 30^oС в течение 16-20 часов. Затем осуществляют четырехкратное пассирование культуры при 43^oС (2 раза по 4 часа с аэрацией и 2 раза по 18 часов без аэрации). Для этого каждый раз переносят по 1 мл культуры в 25 мл стерильного питательного бульона с добавлением эритромицина и линкамицина в селективных концентрациях.

После 4-го пассажа 1 мл культуры засевают в 25 мл бульона BНI без антибиотиков и выращивают в течение суток при 30^oС.

Эффективность температурной элиминации плазмиды pLTV3ts и транспозиции Тn917 в хромосому определяют по фенотипическому выражению чувствительности к тетрациклину и резистентности к эритромицину и линкамицину и подтверждают данными электрофоретического анализа.

Из клеточного депо транспозантов осуществляют высев до изолированных колоний на чашки с L-агаром с добавлением Конго красного.

Посевы инкубируют в термостате при 37^oС в течение 48 часов, затем при комнатной температуре еще 48 часов до появления ярко выраженных различий в морфологии и цвете колоний.

Выросшие колонии просматривают в отраженном свете. Отбирают колонии ярко-красные в S-форме.

Клоны, отличающиеся по морфологии и сорбции пигмента, тестируют на способность к споруляции аналогично примеру 1.

Пример 3 (модификация варианта 1) - получение аспорогенного штамма В. anthracis КМ86(7).

В качестве исходной культуры используют бесплазмидный производный природный штамм В. anthracis 81/1. Получение аспорогенного штамма осуществляют согласно примеру 1, но высев культуры после пассирования производят на L-aгap с добавлением конго красного и отбирают колонии, обладающие одновременно атипичной морфологией (в S-форме) и сорбцией пигмента (ярко-красные).

Аналогично получены аспорогенные штаммы на основе следующих культур сибиреязвенного микроба: B. anthracis CTИ1ΔT, В. anthracis KM34, В. anthracis KM35.

Пример 4 (модификация варианта 1) - получение аспорогенного штамма В. anthracis KM92.

В качестве исходной культуры используют вакцинный штамм В. anthracis 55. Получение аспорогенного штамма осуществляют согласно примеру 1, но после отбора атипичных клонов на L-агаре с добавлением конго красного по одной петле культуры с клонов в S-форме засевают в питательный бульон, разлитый по 2 - 5 мл в пробирки. Инкубируют без аэрации в термостате при 37^oС. Учет результатов осуществляют через 48 часов. Отбирают клоны, образующие при росте равномерное помутнение среды.

Аналогично получен аспорогенный штамм В. anthracis КМ86(9) на основе моноплазмидного токсинообразующего производного природного штамма В. anthracis 81/1.

Таким образом, заявляемый способ позволяет проводить целенаправленный отбор или конструирование аспорогенных штаммов В. anthracis. Используемый для этого диапазон культур сибиреязвенного микроба практически не ограничен. Многократное пассирование приводит к накоплению в популяции штамма В. anthracis спонтанных аспорогенных клонов в количестве, достаточном для их неслучайного обнаружения. Использование транспозонного мутагенеза позволяет получать аспорогенные штаммы на основе культур сибиреязвенного микроба, где выделение спонтанных аспорогенных клонов затруднено. Процедура отбора штамма с нарушением функционального признака спорообразования по сочетанному изменению признака, для которого возможна визуальная оценка (морфология колонии, способность к сорбции пигмента, характер роста в жидкой питательной среде), экономична и эффективна.

Изобретение относится к области микробиологии и генетики и может быть использовано при генетическом конструировании штаммов сибиреязвенного микроба - продуцентов биологически активных веществ. После неоднократного пассирования, приводящего к накоплению в популяции клонов, которые образуют атипичные по морфологии колонии, полученную культуру B.anthracis высевают на твердую питательную среду, инкубируют при 37^oС, а затем при комнатной температуре до появления выраженных морфологических различий между колониями отбирают колонии в S-форме, которые тестируют на способность к образованию спор. При использовании в качестве среды для высева культуры L-агара с добавлением конго красного отбор предлагается осуществлять одновременно по двум признакам: морфологии колоний и пигментсорбции. Предложен вариант способа, в котором вместо этапа пассирования культуры перед высевом проводят транспозонный мутагенез (Тn 917 в составе термоэлиминируемой векторной плазмиды рLTV3ts). Изобретение обеспечивает эффективное получение аспорогенных штаммов на основе широкого диапазона культур сибиреязвенного микроба. 2 с. и 2 з.п. ф-лы.

1. Способ получения аспорогенного штамма Bacillus anthracis, включающий высев культуры на питательную среду до получения изолированных колоний, инкубацию и отбор атипичных колоний с последующим тестированием у них способности к образованию спор, отличающийся тем, что перед высевом культуры проводят неоднократное пассирование до накопления 10-30% клонов, образующих на твердой питательной среде атипичные по морфологии колонии, инкубацию культуры на твердой питательной среде осуществляют при 37^oС в течение 24-48 ч, а отбор клонов проводят по признаку образования колонии в S-форме. 2. Способ получения аспорогенного штамма B. anthracis по п. 1, отличающийся тем, что отобранные колонии с атипичной морфологией в S-форме дополнительно засевают в питательный бульон и отбирают клоны, образующие при росте равномерное помутнение среды. 3. Способ получения аспорогенного штамма B. anthracis по п. 1, отличающийся тем, что в качестве среды для высева культуры и последующего отбора используют L-агар или L-агар с добавлением конго красного, причем в последнем случае отбор осуществляют одновременно по двум признакам: морфологии колоний и пигментсорбции. 4. Способ получения аспорогенного штамма B. anthracis, включающий высев культуры на питательную среду до получения изолированных колоний, инкубацию и отбор атипичных колоний с последующим тестированием у них способности к образованию спор, отличающийся тем, что перед высевом культуры осуществляют транспозонный мутагенез, инкубацию культуры на твердой питательной среде осуществляют при 37^oС в течение 24-48 ч, а отбор клонов проводят по признаку образования колонии в S-форме.