СПОСОБ ХРАНЕНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ ОХЛАЖДЕНИЯ ПРИ ОТСУТСТВИИ КИСЛОРОДА (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2002 года по МПК A01N1/02 A61K35/18 

Область изобретения.

Изобретение относится по существу к жидкому консервированию крови и, более конкретно, к хранению крови в условиях охлаждения в отсутствие кислорода. Изобретение сделано при поддержке правительства по Контракту W-7405-ENG-36, заключенному U.S. Department of Energy с правлением the University of California. Правительство имеет определенные права на это изобретение.

Предпосылки к созданию изобретения
В настоящее время поступление крови значительно ниже, чем потребность в ней. Хранимая кровь оказывается непригодной для использования после около 5-6 недель непрерывного ухудшения при хранении, как установлено, по причине неспособности таких клеток выживать в системе кровообращения после переливания, что частично вызывается окислением и разрушением гемоглобина и истощением аденозинтрифосфата (АТФ). Более того, факторы риска, привносимые с получением крови от неаутологических доноров, остаются значительными. Чтобы удовлетворить существующие потребности в крови, методики хранения крови должны быть простыми, недорогими и долгосрочными.

Красные кровяные тельца (эритроциты) сохраняют жезнеспособность в течение около 4 месяцев в условиях турбулентного потока в организме без синтеза белка. Кислород (О₂) является существенным для превращения гемоглобина (Нb) в метгемоглобин (met-Hb), при разрушении которого образуются токсичные продукты, такие как гемихром, гемин и свободное Fе⁺³. Вместе с O₂ эти продукты катализируют образование гидроксильных радикалов (ОН•), и как ОН•, так и продукты разрушения met-Hb повреждают липидную мембрану эритроцитов, структуру мембраны и содержимое клеток. Как будет обсуждаться ниже, существующие подходы к консервированию эритроцитов не направлены на наносящий вред путь разрушения гемоглобина.

Охлаждение обратимо делает ферменты по существу неспособными к уменьшению met-Hb in vivo, повышает растворимость разрушающего О₂ (почти вдвое) в среде, окружающей эритроциты, и позволяет уровню АТФ снижаться за счет уменьшения скорости гликолиза (при 4^oС скорость составляет около 1% от скорости при 37^oС). Следствием уменьшения концентрации АТФ эритроцитов являются образование пойкилоцитов (нестабильной формы эритроцитов), повышенные скорости везикуляции мембран, потеря удельной поверхности эритроцитов и ускоренная секвестрация селезеночными макрофагами. Везикуляция, которая продолжается в течение периода холодного хранения, усиливается образованием пойкилоцитов и снижает выживаемость эритроцитов за счет уменьшения поверхности мембран эритроцитов.

Эффекты от повышения и сохранения уровней АТФ в случаях хранения крови были изучены. Например, в "Studies in Red Blood Cell Preservation-7. In Vivo and in Vitro Studies With a Modified Phosphate-Ammonium Additive Solution", by Green-walt et al., Vox Sang 65, 87-94 (1993), авторы определили, что экспериментальный добавочный раствор (EAS-2), содержащий в мМ: 20 NH₄Cl, 30 Na₂HPO₄, 2 аденина, 110 декстрозы, 55 маннита, рН 7,15, пригоден для продления сохранности эритроцитов человека при хранении от существующего стандарта 5-6 недель до улучшенного стандарта 8-9 недель. Уплотненные эритроциты пригодны для переливания после удаления супернатанта единственной стадией промывания. Greenwalt и др. заключают, что иные факторы, чем концентрация АТФ, оказывается играют возрастающе важную роль в определении выживаемости эритроцитов после 50 дней хранения. Они цитируют результаты L. Wood и Е. Beutler в "The Viability of Human Blood Stored in Phosphate Adenine Media", Transfusion 7, 401-408 (1967), найденные в их собственных экспериментах, что взаимосвязь между концентрацией АТФ и 24-часовыми измерениями выживаемости эритроцитов оказывается становится менее очевидной после 8 недель хранения. Е. Beutler и С. West вновь заявляют, что взаимосвязь между концентрацией АТФ эритроцитов и выживаемостью является слабой после продолжительных периодов хранения, в "Storage of Red Cell Concentrates in CPD-A2 for 42 and 49 Days", J. Lab. Clin. Med., 102, 53-62 (1983).

В "Effects of Oxygen on Red Cells During Liquid Storage at +4^oC", by Hogman et al., Vox Sang 51, 27-34 (1986), авторы обсуждают, что содержание АТФ эритроцитов чуть лучше обеспечивается при анаэробном, чем при аэробном хранении после 2-3 недель. Венозную кровь охлаждали и лишали дополнительного кислорода во время хранения путем помещения мешков для хранения, способных к пополнению кислородом, в среду азота и тем самым значительного уменьшения уровня насыщения кислородом. Снижение концентрации кислорода происходит медленно при хранении при 4^oС и далеко от завершения, начинаясь от ~60% и достигая ~ 30% насыщения гемоглобина через 5 недель. Никакого заключения не могло быть сделано относительно влияний этой процедуры на общее качество хранимых клеток. Эти авторы не приписывают кислороду или существенно занижают зависящее от кислорода повреждение гемоглобина и опосредованный кислородом вред, наносимый продуктами разрушения гемоглобина.

Соответственно, целью настоящего изобретения является обеспечение способа хранения крови, который направлен на проблемы разрушения гемоглобина, лизис (гемолиз) эритроцитов и истощение АТФ, в смысле согласования с практикой материально-технического обеспечения аутогемотрансфузии и гетерогемотрансфузии, и который позволяет достигнуть значительного продления времени, в течение которого хранение эритроцитов в условиях охлаждения не наносит ущерба для их последующего использования.

Другая цель настоящего изобретения - обеспечить способ пролонгированного хранения крови при сведении к минимуму сложности процедур, необходимых для приготовления образцов крови для переливания.

Дополнительные цели, преимущества и новые свойства изобретения будут изложены частично в следующем описании и частично станут очевидными специалистам в этой области при рассмотрении следующего или могут быть понятыми при практическом применении изобретения. Цели и преимущества изобретения могут быть реализованы и достигнуты посредством технических средств и комбинаций, конкретно указанных в прилагаемой формуле изобретения.

Краткое описание изобретения
Для достижения упомянутых выше и других целей и в соответствии с целями настоящего изобретения, которые воплощены и в общих чертах описаны здесь, способ хранения эритроцитов включает стадии: смешивания образца цельной крови, содержащей эритроциты, которые нужно сохранить, с антикоагулянтным раствором, формирования тем самым первой суспензии эритроцитов, концентрирования эритроцитов из жидкой части (плазмы) первой суспензии, формирования, таким образом, массы уплотненных эритроцитов, смешивания полученных таким образом уплотненных эритроцитов с консервирующим раствором, который включает глюкозу, аденин и соли, формирования за счет этого второй суспензии эритроцитов, снижения уровня кислорода эритроцитов во второй суспензии эритроцитов и охлаждения второй суспензии эритроцитов до 4^oС.

Целесообразно в дальнейшем исключить доступ кислорода к охлажденным эритроцитам.

В другом аспекте настоящего изобретения и в соответствии с объектами и целями настоящего изобретения способ хранения эритроцитов включает стадии: формирования массы уплотненных эритроцитов, смешивания уплотненных эритроцитов с консервирующим раствором, который включает глюкозу, аденин и соли, формирования за счет этого суспензии эритроцитов, снижения уровня кислорода эритроцитов в суспензии эритроцитов и охлаждения суспензии эритроцитов до 4^oС.

Целесообразно в дальнейшем исключить доступ кислорода к охлажденным эритроцитам.

Выгоды и преимущества настоящего изобретения включают сохранение уровней АТФ и снижение гемолиза и накопление мембранных везикул в охлажденных эритроцитах, как следствие создания среды (снижение уровня О₂), которая предотвращает разрушение гемоглобина, в результате чего могут быть продлены периоды полезного хранения в условиях охлаждения.

Краткое описание чертежей
Сопровождающие чертежи, которые приводятся здесь и образуют часть описания, иллюстрируют воплощение настоящего изобретения и вместе с описанием служат для объяснения принципов изобретения.

Фиг. 1 показывает влияние различных газов хранения, как функцию времени, на количество мембранных везикул, накапливающихся во время хранения эритроцитов, обработанных фосфатом аммония при 4^oС.

Фиг. 2 показывает влияние различных газов хранения, как функцию времени, на скорость гемолиза при хранении эритроцитов, обработанных фосфатом аммония при 4^oС.

Фиг. 3 показывает влияние различных газов хранения, как функцию времени, на клеточные уровни АТФ во время хранения эритроцитов при 4^oС в присутствии и в отсутствие фосфата аммония.

Фиг. 4 показывает влияние снижения уровня кислорода на общий АТФ эритроцитов, степень гемолиза и количество потерянных везикул для эритроцитов, хранившихся 3,5 недели при 4^oС по отношению к необработанному контрольному образцу.

Подробное описание изобретения
Кратко, настоящее изобретение включает усовершенствование характеристик выживаемости in vivo подвергшихся переливанию эритроцитов, которые хранились при 4^oС продолжительные периоды времени, путем снижения в них уровня кислорода во время хранения и предотвращения какого-либо доступа кислорода к хранимым эритроцитам. Выявление in vitro гемолиза, образования везикул и уровней АТФ, взятых вместе, обеспечивает полезный показатель выживаемости in vivo. Более того, наблюдается повышение уровней аденозинтрифосфата внутри хранимых эритроцитов в некоторых образцах при добавлении фосфата аммония.

Снижение уровня кислорода и влияние различных консервирующих растворов исследовали с эритроцитами, хранящимися в стандартных мешках для крови из поливинилхлорида (ПВХ) с пластификатором из ди(2-этилгексил)фталата (ДЭГФ), содержащих цитрат, фосфат, хлорид натрия, аденин и декстрозу (раствор антикоагулянта/буфера, AS3) после центрифугирования. Уровень кислорода в теплых эритроцитах снижали промыванием мешков с кровью аргоном 7-10 раз, что снижало уровень кислорода эритроцитов до величины между 8% и 5% соответственно от их уровней насыщения. Каждую порцию крови разделяли (аликвоты около 120 мл) в педиатрические пластифицированные ДЭГФ переносные мешки из ПВХ емкостью 150 мл. Кровь хранили при 4^oС в защищенном от света холодильнике банка крови и образцы отбирали через отверстие для взятия проб со стерильной перегородкой. Быстрое охлаждение после быстрой очистки является существенным для предотвращения накопления молочной кислоты в эритроцитах. Кроме того, следует упомянуть, что уровень кислорода также может быть снижен после охлаждения эритроцитов. Однако поскольку эритроциты не защищены от воздействия окисления, будучи охлажденными, и так как снижение уровня кислорода осуществляется более быстро при 37^oС или 21^oС по сравнению с 4^oС, предпочтительной процедурой является охлаждение их после стадии снижения уровня кислорода. Как сообщалось Hogman et al., см. выше, обычные мешки из ПВХ для хранения крови проницаемы для O₂. Требуется около 4 недель обычного хранения порции уплотненных эритроцитов, чтобы они стали полностью оксигенированными. Чтобы оценить продолжительные воздействия замещения газа хранения, переносные мешки хранят в анаэробной камере, заполненной инертным газом, таким как аргон. Газообмен мешка крови еще усиливают 2-3 циклами частичного вакуумирования анаэробной камеры с последующим заполнением подходящим газом. В дополнение в анаэробную камеру, которая заключает в себе хранимую кровь, помещают генерирующую водород систему с палладиевым катализатором для непрерывного удаления появляющихся следавых количеств O₂.

Эффект дополнительного раствора фосфата аммония для повышения АТФ, названного EAS2 и описанного Greenwalt et аl., см. выше, дополнительно исследован авторами этого изобретения. Как установлено выше, эта добавка дает значительное повышение АТФ, которое замедляется эритроцитами во время продолжительных периодов хранения при 4^oС.

Далее будут приведены подробные разъяснения относительно предпочтительных воплощений настоящего изобретения, примеры которых иллюстрируются сопровождающими чертежами. Так на фиг. 1 демонстрируется влияние различных газов хранения, как функция времени, на накопление мембранных везикул во время хранения эритроцитов, обработанных фосфатом аммония при 4^oС. Представлены количества белка, полученного в форме мембранных везикул, который высвобождается эритроцитами во время хранения с AS3 (обозначение - о), EAS2 (x) и EAS2 плюс аргон (+). Точки данных представляют среднее из 5 отдельных значений. Добавление 10 мМ NH₄ ⁺ в виде NH₄Cl и 20 мМ РO₄ ^-3 в виде Na₂HPO₄ (EAS2) заметно повышает уровни АТФ и снижает образование везикул в течение периода хранения. Очевидно, что снижение уровня O₂ с помощью аргона и поглотителя O₂ (H₂/Pd) дополнительно уменьшает образование везикул. Снижение уровня кислорода с помощью аргона в присутствии (NН₄)₃РO₄ также уменьшает скорости гемолиза и дополнительно повышает уровни АТФ по сравнению с уровнями, достигнутыми при добавлении (NН₄)₃РO₄ без удаления O₂.

Фиг. 2 показывает влияние различных газов хранения, как функцию времени, на скорость гемолиза при хранении эритроцитов, обработанных фосфатом аммония при 4^oС. Представлены гемолиз в процентах с AS3 (о), EAS2 (x) и EAS2 плюс аргон (+). Точки данных представляют среднюю величину из 10 (AS3) или 5 (остальное) отдельных. Степень гемолиза во всех образцах несколько выше, чем ожидаемая для консервированной крови, вследствие опрокидывания и смешивания, что неизбежно перед повторяющимся отбором образцов охлажденных эритроцитов для диагностики in vivo. И снова отчетливо видно усовершенствование по гемолизу в процентах, когда уровень эритроцитов суспензии эритроцитов снижают.

Фиг. 3 показывает влияние различных газов хранения, как функцию времени, на концентрацию АТФ во время хранения эритроцитов при 4^oС в присутствии и в отсутствие фосфата аммония. Общий клеточный АТФ приводится как мкмоль АТФ/г Нb. Символы: (о) - AS3 (контроль), (x) - EAS2 и (+) - EAS2 плюс аргон. Точки данных представляют средние величины из 5-10 отдельных. Обедненные кислородом образцы поддерживают даже более высокие уровни АТФ, чем образцы с добавкой (NН₄)₃РO₄, свыше 11 недель исследования.

Подтверждая описанное изобретение в целом, следующий пример раскрывает подробности его способа.

Пример
Фиг. 4 показывает влияние снижения уровня кислорода на общий АТФ эритроцитов, степень гемолиза и количество потерянных везикул для эритроцитов, хранившихся 3,5 недели при 4^oС, по отношению к необработанному контрольному образцу. Шесть порций уплотненных эритроцитов хранят в консервирующих растворах Adsol и AS3 3-4 дня в коммерческом банке крови. Приблизительно равные объемы сверхчистого Аr вводят в мешок крови, содержащий ~300 мл клеток, при 22^oС и горизонтально и осторожно перемешивают (40 об/мин). Газ заменяют 7 раз через 4-часовой период, в этот момент измеряют насыщение гемоглобина кислородом, оно составляет ~ 5%. Клетки затем помещают в переносные мешки емкостью 150 мл, заключенные в газонепроницаемые канистры, содержащие 90% Аr, 10% H₂ и палладиевый катализатор. Кровь поддерживают при 4^oС. Легко заметить, что все показатели выживаемости in vivo улучшаются только за счет снижения уровня кислорода. Результаты занижены, так как использованные образцы крови уже подвергались охлаждению в присутствии кислорода в течение 2-4 суток.

Вышеизложенное описание изобретения представлено для целей иллюстрации и раскрытия, но не предназначено для того, чтобы быть исчерпывающим или ограничивать изобретение конкретной раскрытой формой, и, ввиду вышеуказанного, возможны, с очевидностью, многие модификации и вариации.

Конкретные воплощения изобретения выбраны и описаны для того, чтобы наилучшим образом объяснить принципы изобретения и его практическое применение и тем самым дать возможность специалистам наилучшим образом использовать изобретение в различных воплощениях и с различными модификациями, которые отвечают требованиям предполагаемого конкретного применения. Имеется в виду, что объем изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения.

Способ хранения эритроцитов включает стадии смешивания образца цельной крови, содержащей эритроциты, с антикоагулянтным раствором с формированием таким образом первой суспензии эритроцитов, концентрирования эритроцитов из жидкой части первой суспензии с получением массы уплотненных эритроцитов, смешивания уплотненных эритроцитов с консервирующим раствором, который включает глюкозу, аденин и соли, с формированием таким образом второй суспензии эритроцитов, снижения уровня кислорода эритроцитов во второй суспензии эритроцитов до примерно 8% от их уровня насыщения или ниже путем промывания эритроцитов инертным газом и охлаждения второй суспензии эритроцитов до 4^oС. Технический результат: способ обеспечивает сохранность качества эритроцитов и продлевает их выживаемость in vivo после переливания крови. 2 с. и 12 з.п. ф-лы, 4 ил.

1. Способ хранения эритроцитов, который включает стадии: а. смешивания образца цельной крови, содержащей эритроциты, которые нужно сохранить, с антикоагулянтным раствором с формированием таким образом первой суспензии эритроцитов; б. концентрирования эритроцитов из жидкой части первой суспензии с получением таким образом массы уплотненных эритроцитов; в. смешивания полученных так уплотненных эритроцитов с консервирующим раствором, который включает глюкозу, аденин и соли, с формированием таким образом второй суспензии эритроцитов; г. снижения уровня кислорода эритроцитов во второй суспензии эритроцитов до примерно 8% от их уровня насыщения или ниже путем промывания эритроцитов инертным газом и д. охлаждения второй суспензии эритроцитов до 4^oС. 2. Способ хранения эритроцитов по п. 1, где указанная стадия снижения уровня кислорода эритроцитов во второй суспензии эритроцитов включает повторяющееся промывание второй суспензии эритроцитов аргоном. 3. Способ хранения эритроцитов по п. 1, дополнительно включающий стадию хранения второй суспензии эритроцитов в проницаемый для кислорода оболочке, которую помещают в свободную от кислорода среду. 4. Способ хранения эритроцитов по п. 1, дополнительно включающий стадию хранения второй суспензии эритроцитов в проницаемый для кислорода оболочке, которую помещают в свободную от кислорода среду, содержащую поглощающие кислород материалы. 5. Способ хранения эритроцитов по п. 1, дополнительно включающий стадию добавления фосфата аммония к второй суспензии для поддержания уровней аденозинтрифосфата в эритроцитах. 6. Способ хранения эритроцитов по п. 1, где указанная стадия снижения уровня кислорода эритроцитов во второй суспензии имеет место до указанной стадии охлаждения второй суспензии до 4^oС. 7. Способ хранения эритроцитов по п. 1, дополнительно включающий стадию промывания эритроцитов солевым раствором, содержащим глюкозу, перед их использованием для того, чтобы снизить в них концентрацию фосфата аммония. 8. Способ хранения эритроцитов, который включает стадии: а. получения массы уплотненных эритроцитов; б. смешивания уплотненных эритроцитов с консервирующим раствором, который включает глюкозу, аденин и соли, с формированием таким образом суспензии эритроцитов; в. снижения уровня кислорода эритроцитов в суспензии эритроцитов до примерно 8% от их уровня насыщения или ниже путем промывания эритроцитов инертным газом и г. охлаждения суспензии эритроцитов до 4^oС. 9. Способ хранения эритроцитов по п. 8, где указанная стадия снижения уровня кислорода эритроцитов в суспензии эритроцитов включает повторяющееся промывание суспензии эритроцитов аргоном. 10. Способ хранения эритроцитов по п. 8, дополнительно включающий стадию хранения суспензии эритроцитов в проницаемой для кислорода оболочке, которую помещают в свободную от кислорода среду. 11. Способ хранения эритроцитов по п. 8, дополнительно включающий стадию хранения суспензии эритроцитов в проницаемой для кислорода оболочке, которую помещают в свободную от кислорода среду, содержащую поглощающие кислород материалы. 12. Способ хранения эритроцитов по п. 8, дополнительно включающий стадию добавления фосфата аммония к суспензии для поддержания уровней аденозинтрифосфата в эритроцитах. 13. Способ хранения эритроцитов по п. 8, где указанная стадия снижения уровня кислорода эритроцитов в суспензии эритроцитов имеет место до указанной стадии охлаждения суспензии до 4^oС. 14. Способ хранения эритроцитов по п. 8, дополнительно включающий стадию промывания эритроцитов солевым раствором, содержащим глюкозу, перед их использованием для того, чтобы снизить в них концентрацию фосфата аммония.