ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ БИОЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2002 года по МПК C07K7/08 A61K38/10 A61P31/04 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к новым пептидным структурам, обладающим биоцидными, в частности антибактериальными свойствами.

К настоящему времени в фармакологии и медицине сложилась ситуация, которую можно охарактеризовать как накопление толерантности к довольно широкому перечню фармакологических препаратов. Это в первую очередь касается антибиотиков. Многие из традиционных антибиотиков, которые во второй половине нашего века были основным инструментом борьбы с различными инфекциями, постепенно теряют свои активные качества вследствие постоянного увеличения числа бактериальных штаммов, устойчивых к используемому препарату (Cassell G.H. Emergent antibiotic resistance: health risks and economic impact // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 1997. - v.18.- 4.-p.271-274).

Разработка новых активных антибактериальных соединений чрезвычайно актуальна. Одним из возможных путей решения проблемы является создание препаратов на основе антибиотических пептидов, которые в настоящее время применяются в практической медицине или проходят клинические испытания как антибиотические, антикандидозные и противоопухолевые средства (Hancock R.E.V. Peptide antibiotics // Lancet - 1997.-v.349.-N 4.-р.418-422; Andreu D., Rivas L. Animal antimicrobial peptides: an overview // Biopolymers (Peptide Science) - 1998.- v.47.- 6.-p.415-433).

Механизм уничтожения клеток микроорганизмов такими пептидами связан со способностью этих соединений образовывать при взаимодействии с двойным слоем липидной мембраны клеток амфипатичные спирали, для которых характерны катион обогащенные и гидрофобные участки, что приводит к лизису клетки.

Побочным действием антибиотических пептидов на фоне их высокого антибиотического эффекта является цитолитическая активность в отношении ряда нормальных клеток / Bikshapathy E., Sitaram N., Nagaraj R. Addition and omission analogs of the 13-residue antibacterial and hemolytic peptide PKLLKTFLSKWIG: structural preferences, model membrane binding and biological activities // J.Pept.Res. - 1999.-v.53.- 1.-р.47-55/.

Наиболее близким к заявляемому решению по структуре и свойствам являлся пептид индолицидин общей формулы (1):
(1) H-Ile-Leu-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-NH₂, (Selsted M. E. , Novotny M.J., Morris W.L, Tang Y.Q., Smith W., Cullor J.S., Indolicidin, a novel bactericidal tridecapeptide amide from neurophils. // J.Biol. Chemistry. - vol.267. - 7. - 1992. - p.4292-4295), который обладает антимикробным действием по отношению к широкому кругу микроорганизмов, в частности к бактериям, грибам, вирусам и т.д.

Недостатком индолицидина является наличие высокой гемолитической активности.

Задачей, стоящей перед авторами при создании настоящего изобретения, являлась разработка более эффективных и безопасных пептидов, лишенных побочного цитотоксического эффекта в отношении эритроцитов крови, то есть не обладающих гемолитической активностью.

Было найдено, что стоящая перед авторами задача решается путем создания пептида общей формулы (2):
(2) H-a-Lys-b-Trp-Lys-c-Pro-d-Lys-Pro-Trp-e-Arg-NH₂,
где а = -Ile- или -Lys-;
b = -Pro- или -Lys -;
c, d = -Lys- или -Тrр-;
e = -Arg- или -Ala-.

Лучшие результаты были получены при использовании пептидов (3-7)
(3) H-Ile-Lys-Pro-Trp-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH₂,
(4) H-Ile-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH₂,
(5) H-Ile-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Ala-Arg-NH₂,
(6) H-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Lys-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH₂,
(7) H-Ile-Lys-Lys-Trp-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH₂.

Пептиды получают твердофазным методом Меррифилда (Memfield R.B. and Barany G. Solid Phase peptide synthesis. // The Pepthides. Analysis Synthesis, Biology. - Eds. Gross K., Meinhofer J., N.Y. - Academic Press. - 1980. - vol. 2. - р.3.) на метилбензгидриламинополимере с использованием Вос-технологии.

Для временной защиты α-аминогрупп используют трет.-бутилоксикарбонильную защитную группировку. Индольные кольца триптофана блокируют формильной группой, гуаногруппы аргинина - нитрогруппами, ε-аминогруппы лизина- 2-хлорбензилоксикарбонильной защитой. Наращивание пептидной цепи осуществляют с помощью оксибензотриазоловых эфиров с нейтрализацией in situ (Schnolzer M., Alewood P. , Jones A., Alewood D., Kent S.B.H. In situ neutralization solid phase peptide synthesis. Rapid, high yield assemdly of difficult sequences. // Int.J.Pept.Prot.Res. - 1992.-v.40.- 2 -p.180-193).

Полноту протекания реакции контролируют нингидриновым тестом. Отщепление от смолы и удаление защитных групп проводят в два этапа. На первом этапе, непосредственно на полимере с помощью пиперидина удаляют формильные группы, на втором этапе - фтористым водородом в присутствии анизола производят окончательное деблокирование и отщепление пептида от смолы.

Очистку синтезированных пептидов проводят с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления (ВЖХ) на обращенной фазе.

Чистота полученных при этом препаратов была более 95%. Все они имели удовлетворительный аминокислотный анализ и были индивидуальны по данным аналитической ВЭЖХ.

Промышленная применимость изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Синтез пептида H-Ile-Lys-Pro-Trp-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH₂ (3)
Для синтеза пептида загружали в реакционный сосуд 0.2 г. N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ω-нитро-аргинин-метил-бензгидриламинополимера в 10 мл диметилформамида. Содержание аргинина 1,0 ммол/г полимера. Пептидную цепь далее наращивали с С-конца по программе, приведенной в табл. 1.

Если нингидриновый тест положителен, повторяли конденсацию, начиная с п. 7.

Для синтеза пептида (3) к исходному N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ω-нитро-L-аргинин-метилбензгидриламинополимеру по программе, приведенной в табл. 1, последовательно присоединяли N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ω-нитро-L-аргинин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_in-формил-L-триптофан, трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N_α-трет-бутил-оксикарбонил-N_in-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N_α-трет-бутил-оксикарбонил-N_in-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин и N-трет-бутилоксикарбонил-L-изолейцин.

По завершении синтеза пептидил-полимер высушивали в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора и 0,2 г пептидил-полимера деблокировали по программе, приведенной в табл. 2.

Лиофилизат подвергали очистке обращенно-фазовой хроматографией на колонке С 18 Nova Pack 19•300 в градиенте 0-70% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте. Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 95%. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.

Пример 2. Синтез пептида H-Ile-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH₂ (4)
Синтез, деблокирование, очистка и характеристика пептида (4) осуществляли теми же способами, что и пептида (3) по примеру 1, за исключением того, что для его получения к исходному N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ω-нитро-аргинин-метилбензгидриламино-полимеру по программе, приведенной в таблице 1, последовательно присоединяли N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ω-нитро-L-аргинин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_in-формил-L-триптофан, трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_in-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_in-формил-L-триптофан, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_in-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин и N-трет-бутилоксикарбонил-L-изолейцин.

Полученный в результате деблокирования по программе, приведенной в табл. 2, лиофильно высушенный пептид подвергали очистке обращенно-фазовой хроматографией на колонке С 18 Nova Pack 19•300 в градиенте 0-70% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте.

Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 95%. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.

Пример 3. Синтез пептида H-Ile-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Ala-Arg-NH₂ (5)
Синтез, деблокирование, очистка и характеристика пептида (5) осуществляются теми же способами, что и пептида (3) по примеру 1, за исключением того, что для его получения к исходному N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ω-нитро-L-аргинин-метилбензгидриламинополимеру по программе, приведенной в табл. 1, последовательно присоединяли N-трет-бутилоксикарбонил-L-аланин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_in-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N_α-трет-бутилоксикарбонилхлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N_α-трет-бутилокси-карбонил-N_in-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_in-формил-L-триптофан, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин,N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_in-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин и N-трет-бутилоксикарбонил-L-изолейцин.

Полученный в результате деблокирования по программе, приведенной в табл. 2, лиофильно высушенный пептид подвергали очистке обращенно-фазовой хроматографией на колонке С 18 Nova Pack 19•300 в градиенте 0-70% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте.

Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 95%. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.

Пример 4. Синтез пептида H-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Lys-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH₂= (6)
Синтез, деблокирование, очистка и характеристика пептида (6) осуществляются теми же способами, что и пептида (3) по примеру 1, за исключением того, что для его получения к исходному N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ω-нитро-L-аргинин-метилбензгидриламино-полимеру по программе, приведенной в табл. 1, последовательно присоединяли N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ω-нитрo-L-аргинин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_in-формил-L-триптофан, трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_in-формил-L-триптофан, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_in-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин и N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин.

Полученный в результате деблокирования по программе, приведенной в табл. 2, лиофильно высушенный пептид подвергали очистке обращенно-фазовой хроматографией на колонке С 18 Nova Pack 19•300 в градиенте 0-70% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте.

Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 95%. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.

Пример 5. Синтез пептида H-Ile-Lys-Lys-Trp-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH₂ (7)
Синтез, деблокирование, очистка и характеристика пептида (7) осуществляются теми же способами, что и пептида (3) по примеру 1, за исключением того, что для его получения к исходному N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ω-нитро-L-аргинин-метилбензгидриламинополимеру по программе, приведенной в табл. 1, последовательно присоединяли N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ω-нитро-L-аргинин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_in-формил-L-триптофан, трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_in-формил-L-триптофан, N-трет-бутилоксикарбонил-L-пролин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_in-формил-L-триптофан, трет-бутилоксикарбонил-N_ε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин, N_α-трет-бутилоксикарбонил-N_ε-хлорбензилоксикарбонил-L-лизин и N-трет-бутилоксикарбонил-L-изолейцин.

Полученный в результате деблокирования по программе, приведенной в табл. 2, лиофильно высушенный пептид подвергали очистке обращенно-фазовой хроматографией на колонке С 18 Nova Pack 19•300 в градиенте 0-70% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте.

Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 95%. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.

Пример 6. Влияние синтезированных пептидов на рост микроорганизмов.

Культуры клеток, выращенные на твердой питательной среде, выдерживали сутки в холодильнике при +6^oС. Перед измерением клетки снимали петлей в жидкую среду LB и доводили концентрацию до 5•10⁶ -10⁷ клеток/мл. В стерильные планшеты "Costar" для клеточных культур (96 ячеек) вносили по 50 мкл раствора пептида в воде (концентрация 200 мкг/мл) и по 100 мкл суспензии клеток в среде LB, и проводили далее разбавление с шагом 2. Инкубировали планшеты в течение 16 часов при 37^oС, встряхивали планшеты при комнатной температуре в течение 20-30 минут для взвешивания клеток и снимали показатели оптической плотности на ридере для планшет при длине волны 490 нм.

Считали средний контроль (без пептида) и оценивали % подавления роста микроорганизма по сравнению с контролем.

Результаты испытаний приведены в табл. 3.

Пример 7. Гемолитическая активность пептидов.

Эритроциты человека (кровь берется на гепарин) отмывали 3 раза верональным буфером (VBS) и разводили до концентрации 0,5% (об.) в VBS. Образцы пептидов разводили в концентрации 200 мкг/мл в VBS, при этом начальная концентрация пептида в ячейке составляла 100 мкг.

Раствор пептида вносили в ячейки стерильной планшеты для клеточных культур фирмы "Costar", начиная с концентрации 100 мкг препарата и 50 мкг эритроцитов человека в ячейку. Проводили раститровывание с шагом 2. Планшеты инкубировали 1 час при 37^oС, центрифугировали, отбирали супернатант и проводили скрининг оптической плотности при 415 нм.

В качестве контроля использовали: К₁ - VBS без пептида; К₂ - VBS с 1% тритоном Х-100. Полученные показатели гемолиза обрабатывали по формуле:

Результаты испытаний приведены в табл. 4.

Полученные данные свидетельствуют, что пептиды заявляемой структуры сочетают более высокую по сравнению с индолицидином биоцидную активность с отсутствием повреждающего воздействия на клетки крови. Проведенные испытания пептидов при внутреннем введении в дозе до 1,5 мг/кг путем инъекции соединения в физиологическом растворе в хвостовую вену белых беспородных мышей показали отсутствие токсичности для всех предлагаемых пептидов.

Изобретение относится к новым пептидам общей формулы 1 H-a-Lys-b-Trp-Lys-c- Pro-d-Lys-Pro-Trp-e-Arg-NH₂, где а = -Ile- или -Lys-; b= -Pro - или -Lys-; с, d = -Lys- или -Trp-; е=Arg или Ala, обладающий биоцидной активностью, которые сочетают более высокую по сравнению с индолицидином биоцидную активность с отсутствием повреждающего воздействия на клетки крови. 4 табл.

Пептид общей формулы
H-a-Lys-b-Trp-Lys-c-Pro-d-Lys-Pro-Trp-e-Arg-NH₂,
где а = -Ile- или -Lys-;
b = -Pro- или -Lys-;
с, d = -Lys- или -Trp-;
е = Arg или Ala,
обладающий биоцидной активностью.