Изобретение относится к медицинской и пищевой биотехнологии и может быть использовано для получения лекарственных препаратов пробиотиков, а также для получения продуктов функционального назначения в молочной промышленности.
Известный штамм Bifidobacterium bifidum B-3300, используемый в производстве бактерийных препаратов, сквашивает молоко в течение 18-24 часов, обладает антагонистической активностью против S.sonnei, S.flexneri, E.coli (220), S.aureus, устойчив к канамицину, мономицину, чувствителен к антибиотикам пенициллинового ряда, кефзолу, гентамицину (см. патент SU 2023396, кл. А 23 С 9/12, 1994 г.).
Недостатком известного штамма является недостаточно высокая биологическая активность и технологичность.
Задачей изобретения является изыскание штамма бактерий вида В.bifidum с более высокой биологической активностью, устойчивого к условиям внешней среды, хорошо сквашивающего молоко и быстро размножающегося на искусственных питательных средах, обладающего стабильным кислотообразованием во всем температурном диапазоне развития клеток.
Новый штамм Bifidobacterium bifidum 45 выделен из кишечника здорового взрослого человека, депонирован в "ГНИИгенетика" под номером ВКПМ Ас-1621.
Культурально-морфологические признаки.
Полиморфные грамположительные палочки изогнутые или с раздвоениями на концах, неподвижные, в жидких питательных средах растут по всему объему, кроме зоны аэробиоза. Культура штамма пигмент не образует. На плотной среде с азидом Na растет блестящими колониями, окрашенными в синий и темно-фиолетовый цвета. На средах Блаурокка, гидролизатно-молочной, казеиново-гидролизатной, "Эпидермате" и тиогликолевой логарифмическая фаза роста заканчивается к 16-18 часам. Общая кислотность на среде Блаурокка к 24 часам достигает 90-100oТ. Оптимальная температура выращивания 37,5-40,5oС. Лучший способ накопления биомассы - выращивание культуры на казеиново-гидролизатной среде. Среда высушивания сахарозо-желатиновая. В лиофильном виде сохраняется от 1 года до 7 лет.
Физиолого-биохимические признаки.
Облигатный анаэроб. Ферментирует целлобиозу, лактозу и глюкозу с образованием уксусной и L + молочной кислот, арабинозу, ксилозу, рибозу, маннит, мелицитозу, салицин не ферментирует.
Сбраживает молоко за 14-16 часов с образованием стабильного сгустка при кислотности 90-110oТ. Каталазу не образует, желатин не разжижает.
Изучена способность штамма B.bifidum Ac-1621 сквашивать молоко в лабораторных условиях, в бутылях и ферментационных блоках объемом от 2 до 10 л. В условиях производства в резервуарах от 0,3 до 1 т. Данные по скорости сквашивания приведены в таблице 1.
Антагонистические свойства.
Штамм бифидобактерий В.bifidum 45 ВКПМ Ac-1621 подавляет рост шигелл Зонне, Флекснера, энтеропатогенных кишечных палочек, золотистых стафилококков, клебсиелл, протеев и других условно патогенных микроорганизмов.
Данные по антагонистической активности штамма B.bifidum Ас-1621 и его прототипа в отношении E.coli, S.sonnei, S.aureus, P.mirabilis отражены в таблице 2.
Антибиотикоустойчивость штамма.
Устойчивость к антибиотикам проводилась с использованием серийных разведений в жидкой питательной среде Блаурокка.
В пробирки с разведениями вносили по 1 мл суточной суспензии бифидобактерий (КОЕ-106). Экспозиция опыта - 48 ч. Данные опытов приведены в таблице 3.
Сравнительное изучение биологических свойств штаммов Bifidobacterium bifidum 45 ВКПМ Ac-1621 и Bifidobacterium bifidum B-3300 показало, что новый штамм B.bifidum 45 ВКПМ Ас-1621 более устойчив к действию канамицина, мономицина, гентамицина, левомицитина, кефзола, стрептомицина, ампициллина, чем известный штамм B.bifidum 791 (B-3300).
Адгезивные свойства бифидобактерий.
Адгезивные свойства изучались на модели формалинизированных эритроцитов человека и энтероцитах белых крыс. Адгезивность штамма оценивалась по среднему показателю адгезии (СПА). Среди изучаемых штаммов в данных исследованиях штамм B. bifidum 45 ВКПМ Ас-1621 показал высокую степень адгезии - СПА равен 9,8-10.
Бактериоциногенные свойства
Бактериоциногения штамма изучалась с помощью отсроченного антагонизма по Фредерику в нашей модификации. Опыты проводились на плотной питательной среде Блаурокка в анаэробных условиях. Для изучения бактериоциногенности штамма пользовались набором индикаторных культур (чувствительных к бактериоцинам) бифидобактерий, полученных из музея МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского.
Штамм бифидобактерий B. bifidum 45 ВКПМ Ac-1621 выделяет бифидоцины и образует зону задержки роста индикаторных культур от 2 до 3,5 мм.
Иммуномодулирующая активность штамма изучалась в реакции бластрансформации клеток селезенки интактных мышей СВА. Инкубация спленоцитов проводилась в присутствии живых микробных клеток изучаемого штамма, концентрация которых в опытных пробах составила 1•109, 1•108, 1•107 КОЕ/мл, а также в присутствии Т-митогена Кон А (2 мкг/мл) и в среде без митогенов (контроль). Спленоциты инкубировали в СО2 инкубаторе при 5% CO2 при температуре 37oС. За 16 часов до окончания инкубации вносили 1 мкл 3H-тимидина с удельной активностью 1 Ки/моль. Меченые клетки переносили с помощью харвенстера на стекловолокнистые фильтры Fg/c с последующим подсчетом радиоактивности.
Реакция бласттрансформации (активное деление лимфоцитов) клеток селезенки мышей приводит к увеличению размеров лимфоцитов, их метаболитической активизации и в конечном итоге к клеточной пролиферации. Пролиферативную активность лимфоцитов определяют с использованием неспецифических митогенов. Оценку реакции ответа на митогены осуществляют по включению меченого тритием тимидина в реплицирующуюся ДНК.
Реакция бласттрансформации позволила оценить иммуномодулирующую активность микробных клеток изучаемых культур бифидобактерий, в том числе и штамма B.bifidum 45 ВКПМ Ac-1621, которую определяют пролиферативной активностью спленоцитов (см. таблицу 4).
Выявлено влияние клеток бифидобактерий на пролиферативную активность клеток селезенки интактных мышей.
Показана зависимость пролиферативной активности спленоцитов от вида бифидобактерий, штамма и дозы штамма, содержащейся в среде инкубации бифидобактерий.
Штамм B. bifidum 45 ВКПМ Ас-1621 обладает более выраженным иммуностимулирующим воздействием, чем прототип B.bifidum В-3300.
Таким образом, описываемый штамм отличается от прототипа тем, что обладает более выраженными иммуностимулирующими свойствами, более высокой степенью адгезии, бактериоциногенностью, антагонистической активностью к патогенным и условно патогенным микроорганизмам, спектр антибиотикоустойчивости шире, чем у прототипа.
Накопление биомассы до величины lg КОЕ/г 9,2-9,7 на ГМ среде происходит через 16-18 ч.
Сквашивание молока до рН 4,6-4,8 происходит через 12-16 часов.
Пример 1.
Приготовление кисломолочного продукта.
Кисломолочный продукт готовят на молоке коровьем I сорта ГОСТ 13264-88, кислотностью 18oТ, плотностью 1,020 г/см3.
Приготовление закваски.
Штамм активизируют на гидролизатно-молочной среде (ГМ) в течение 2-х генераций, 3-ю генерацию осуществляют на молоке. Приготовление 3-й генерации микроорганизмов (рабочей закваски) проводят в течение 10-12 часов до рН 4,9-5,2. Оптимальная температура для приготовления закваски 37,5-39oС.
Готовую закваску вносят в стерильное или пастеризованное молоко из расчета 3-5% к объему молока и оставляют при температуре 37,5-39oС на 10-12 часов. Кислотность (рН) измеряли с помощью потенциометра через 4-6-8-10-12 часов. Смесь с рН 4,9-5,2 была готова через 10 часов, образование хорошего сгустка наступило через 11-12 часов с кислотностью 85-90oТ.
Таким образом, предлагаемый штамм зарекомендовал себя как технологичный для молочной промышленности.
Пример 2.
Лабораторно-экспериментальная серия лиофилизированной биомассы бифидобактерий штамма B.bifidum 45 ВКПМ Ac-1621 использовалась в качестве препарата пробиотика при коррекции микробиоценоза кишечника у больных, страдающих постэнтероколитическим реактивным артритом (РеА).
Группа больных - добровольцев из 25 человек на фоне базисной терапии принимала сухой препарат из лиофилизированной биомассы штамма B.bifidum 45 ВКПМ Ас-1621. Клинические наблюдения и исследование клеточного иммунитета проводили квалифицированные врачи Института ревматологии РАМН. Определение иммунного статуса проводили в динамике: до лечения и через 1-3 месяца после приема препарата. Препарат принимали по 5-10 доз в день.
Для оценки сдвигов в численности отдельных субпопуляций лимфоцитов определяют относительное и абсолютное количество лимфоцитов, Т-клеток, зрелых Т-клеток, незрелых Т-клеток, Т-хелперов, Т-супрессоров, В-клеток, величину хелперно-супрессорного отношения. Во все сроки исследования определяют абсолютное количество клеток данной субпопуляции в мкл крови и выражают в % к абсолютному количеству таких клеток у пациента до начала лечения.
Изучение иммунного статуса у больных постэнтероколитическим реактивным артритом показало, что исходный иммунный статус характеризуется сниженной относительной и абсолютной численностью зрелых Т-хелперов: 47,7% и 920 кл/мкл против 57% и 1270 кл/мкл у здоровых людей.
В процессе лечения у всех больных происходило увеличение практически всех субпопуляций лимфоцитов, причем в большей степени увеличивалась численность Т-хелперов.
В группе больных, получавших только "базисную" терапию, исходный уровень численности всех популяций лимфоцитов находился гораздо ниже нормы.
Микрофлора кишечника изучалась до и после приема препарата, который назначался в комплексном лечении с "базисным" препаратом салазопиридазином.
До приема препарата дисбактериоз кишечника (ДК) IV степени отмечался у 97,7% больных.
Курс лечения проводился в течение 3 месяцев. Микробиоценоз кишечника при РеА изучался в динамике: до лечения, после 1-го и 3-го месяцев лечения. В микробиоценозе кишечника до лечения отмечалось отсутствие или снижение до 105 уровня бифидобактерий и лактобактерий, а также повышенное количество условно патогенных микроорганизмов.
Частота обнаружения энтеробактерий коррелировала с активностью РеА.
После месячного применения препарата наблюдалась положительная динамика в микрофлоре.
Так больные, имеющие IV степень дисбактериоза, теперь имели I-II степень, у больных с II-III степенью микрофлора нормализовалась.
Параллельно изучалась динамика изменений в иммунной системе больных. В процессе лечения происходило увеличение практически всех субпопуляций лимфоцитов.
Применение препарата из нового штамма в комплексном лечении с "базисной" терапией приводит к клиническому улучшению состояния больных РеА, а также к нормализации микробиоценоза кишечника, что подтверждает наличие иммуномодулирующего действия у препарата, изготовленного из нового пробиотического штамма бифидобактерий B.bifidum 45 ВКПМ Ac-1621.
Таким образом, новый штамм можно рекомендовать для приготовления препаратов пробиотиков, продуктов функционального питания и биологически активных добавок.
Изобретение относится к медицинской и пищевой промышленности и может быть использовано для получения лекарственных препаратов пробиотиков, БАДов, а также для получения продуктов функционального питания в молочной промышленности. Штамм Bifidobacterium bifidum 45 ВКПМ Ас-1621 обладает широким спектром антибиотикоустойчивости, хорошей адгезивностью, более выраженным иммуномодулирующим действием на человеческий организм. 4 табл.
Штамм Bifidobacterium bifidum 45 ВКПМ Ас-1621, используемый для приготовления бактериальных препаратов и продуктов питания.
