ШТАММ BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM ВКПМ АС-1578, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ И ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ Российский патент 2000 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 A23C9/12 

Изобретение относится к медицинской, пищевой биотехнологии и может быть использовано для получения лекарственных препаратов пробиотиков и для получения продуктов функционального назначения в молочной промышленности, а также как аутоштамм для создания препарата пробиотика индивидуального назначения.

Известный штамм Bifidobacterium bifidum 791, используемый в производстве бактерийных препаратов, сквашивает молоко в течение 18-24 часов, обладает антагонистической активностью против Sh.sonnei, Sh.flexneri, E.coli (220), S.aureus, устойчив к канамицину, мономицину, чувствителен к антибиотикам пенициллинового ряда, кефзолу, гентамицину (см. RU, патент N 2023396 С1, кл. А 23 С 9/12, 30.11.94).

Недостатком известного штамма является недостаточно высокая биологическая активность и технологичность.

Задачей изобретения является изыскание штамма микроорганизмов вида В. bifidum с более высокой биологической активностью, устойчивого к условиям внешней среды, к воздействию экстремальных факторов, хорошо сквашивающего молоко и быстро размножающегося на искусственных питательных средах, обладающего стабилизирующим кислотообразованием во всем температурном диапазоне развития клеток. Новый штамм Bifidobacterium bifidum Ac-1578 выделен из кишечника здорового взрослого человека (от космонавта) и экспонирован в условиях невесомости на ОС "Мир". Bifidobacterium bifidum депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером Ас-1578.

Культурально-морфологические признаки.

Полиморфные грамположительные палочки, изогнутые или с раздвоениями на концах, неподвижные, в жидких питательных средах растут по всему объему кроме зоны аэробиоза. Пигмент не образуют. На плотной среде с азидом Na растут колониями выпуклыми, блестящими, окрашенными в синий и темно-фиолетовый цвета. На среде Блаурокка, гидролизатно-молочной, казеиново-гидролизатной, "Эпидермате", тиогликолевой логарифмическая фаза роста заканчивается к 14-18 часам. Кислотность на среде Блаурокка к 72 часам достигает 95-100^oT. Оптимальная температура выращивания 37,5-38^oC. Лучший способ накопления биомассы на гидролизатно-молочной среде с добавлением молока. Среда высушивания сахарозо-желатиновая. В лиофильном виде сохраняются от 1 года до 10 лет.

Физиолого-биохимические признаки.

Облигатный анаэроб. Ферментирует целлобиозу, лактозу и глюкозу с образованием уксусной и L+ молочной кислот, арабинозу, ксилозу, рибозу, маннит, мелицитозу, салицин не ферментирует.

Сбраживает молоко за 10-12 часов с образованием стабильного сгустка. Каталазу не образует, желатину не разжижает.

Изучена сквашивающая способность штамма Ас-1578 в лабораторных условиях, в ферментационных блоках объемом 250, 650 л и в условиях производства в резервуарах (танках) от 1 т до 6 т. Данные по скорости сквашивания приведены в таблице 1.

Антагонистические свойства.

Подавляет рост шигелл Зонне, Флекснера, энтеропатогенных кишечных палочек, золотистых стафилококков, клебсиелл, протеев и других условно-патогенных микроорганизмов.

Антагонистическая активность в отношении E.coli, Sh.sonnei, S.aureus, Pr. mirabilis существенно выше (см. таблицу 2).

Антибиотикоустойчивость штамма.

Штамм устойчив к ампициллину, карбенициллину, стрептомицину, гентамицину, канамицину, мономицину, кефзолу, чувствителен к тетрациклину, пенициллину, оксациллину, ампициллину.

Устойчивость к антибиотикам проводилась с использованием серийных разведений в жидкой питательной среде Блаурокка. В пробирки с разведениями вносили по 1 мл суточной суспензии бифидобактерий (КОЕ=10⁶).

Экспозиция опыта - 48 ч.

Данные опытов приведены в таблице 3.

Сравнительное изучение биологических свойств штаммов Bifidobacterium bifidum Ac-1578 и Bifidobacterium bifidum В-3300 показало, что новый штамм Ас-1578 более устойчив к действию ампициллина, гентамицина, левомицитина, кефзола, чем известный штамм B.bifidum 791 (В-3300).

Обладает высокими показателями адгезивности, выявленными на моделях формализованных эритроцитах человека - СПА = 11,2.

Изучение культуральных свойств на средах гидролизатно-молочной, Блаурокка, тиогликолевой подтвердило, что КОЕ lg 9,5-9,7 у штамма Ас-1578 составляло через 14-18 часов, а у штамма B.bifidum 791 (В-3300) через 16-24 часа.

При совместном культивировании бифидобактерий разных видов, например в заквасках, важно учитывать также такие биологические свойства штаммов, с помощью которых может произойти подавление одного штамма другим, например способность штаммов образовывать бактериоцины.

В экспериментах показано, что штамм B.bifidum Ac-1578 не является бактериогенным и не обладает бактериоциночувствительностью к штаммам бифидобактерий вида B.longum, что позволяет использовать его при совместном культивировании двух указанных видов в заквасках и в составе комплексного бакпрепарата или ассоциативной закваски.

Штамм рекомендуется для приготовления препаратов пробиотиков функционального назначения и лечебно-диетических кисломолочных продуктов.

Пример 1. Для приготовления кисломолочного продукта берут 1 л цельного стерилизованного молока, остужают до температуры 37-39^oC, вносят 1 г лиофилизированной культуры бифидобактерий штамма B.bifidum Ac-1578, хорошо размешивают и оставляют при температуре 37-39^oC на 9 ч до получения сгустка. Таким образом, получают производственную закваску, которую вносят в ферментер или в подготовленный резервуар с охлажденной до 37-39^oC молочной смесью. После внесения закваски смесь перемешивают в течение 15 мин. Количество закваски берут из расчета 4% от массы заквашиваемого молока. Процесс сквашивания кисломолочного продукта производят в ферментерах 8 ч, в резервуарах 10 ч до pH 4,7 (кислотность 90^oT).

Полученный продукт обладает приятным кисломолочным вкусом, стабильным сгустком и содержит 10⁷- 10⁹ живых бифидобактерий.

Пример 2. Больной М.-35 лет получал на фоне стрессиндуцированного дисбактериоза кишечника IV степени выраженности лиофилизированную биомассу бифидобактерий штамма Ас-1578 в количестве 5 доз (1 флакон -5•10^7-8 КОЕ) по 2 раза в день во время еды или после еды в течение 10 дней.

Через 5 дней отмечено исчезновение явлений дискомфорта со стороны желудочно-кишечного тракта и функциональных расстройств кишечника. Бактериологическое исследование показало, что уже на 7 сутки происходило увеличение бифидобактерий в 1000 раз, а увеличение лактобацилл констатировано в 100 раз. Параллельно отмечено снижение условно-патогенных энтеробактерий в 100 раз и снижение уровня стрептококков также в 100 раз. Одновременно имело место исчезновение эшерихий с измененной ферментативной активностью. Состояние микробиоценоза кишечника расценивается после проведения курса лечения как дисбактериоз I степени выраженности.

Кроме того, лекарственная форма бактериальных препаратов может быть изготовлена в виде таблеток, капсул или порошка.

Промышленная применимость.

Свойства штамма B.bifidum Ac-1578 стабильны и не меняются при хранении, в процессе культивирования и при воздействии экстремальных факторов.

Описываемый штамм обладает хорошими технологическими показателями - способностью к максимальному накоплению микробной массы в короткие сроки -14-18 ч большой скоростью кислотообразования - сквашивает молоко за 8-12 ч, причем титр бифидобактерий достигает 5 •10⁷- 1•10⁸.

Биопрепараты на основе предложенного штамма длительно сохраняют исходную активность. Штамм B.bifidum Ac-1578 может быть использован в продуктах питания для космонавтов из-за своей устойчивости к условиям невесомости. Кроме того, штамм обладает широким спектром антибиотикоустойчивости, высокой адгезивностью, не бактериоциночувствителен к другим видам бифидобактерий, что дает возможность использовать его для комплексных препаратов пробиотиков и ассоциативных заквасок.

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в медицине для получения бактериальных препаратов и как аутоштамм для приготовления препарата пробиотика индивидуального назначения, а также в пищевой промышленности при производстве кисломолочных продуктов и БАДов. Штамм Bifidobacterium bifidum ВКПМ Ас-1578 обладает широким спектром антибиотикоустойчивости, высокой адгезивностью, не бактериоциночувствителен к другим видам бифидобактерий. Свойства штамма стабильны и не меняются при хранении, в процессе культивирования и при воздействии экстремальных факторов. 3 табл.

Штамм Bifidobacterium bifidum ВКПМ Ac-1578, используемый для приготовления бактериальных препаратов и продуктов питания.