ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS THURINGIENSIS БИОС-1, ОБЛАДАЮЩИЙ ИНСЕКТОАКАРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 C12R1/07 A01N63/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, микробиологии и биотехнологиии, а именно к производству бактериальных биопрепаратов, предназначенных для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур, являющихся представителями отрядов Lepidoptera, Coleoptera, Homoptera, Thysanoptera и Acariformes.

Эффективная борьба с вредителями играет важную роль в сохранении и увеличении урожая, поскольку потери сельскохозяйственной продукции, связанные с жизнедеятельностью насекомых-вредителей, составляют до 30% от ожидаемого урожая.

В настоящее время для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур широко применяют химические препараты. Длительное использование последних привело к формированию устойчивых к этим препаратам популяций вредителей [1]. Кроме того, химические препараты токсичны для теплокровных животных и полезных насекомых, а также способны проникать в растения, что ухудшает санитарно-гигиенические показатели сельскохозяйственной продукции. Наиболее широко применяемым из химических препаратов является карбофос.

Все возрастающую роль в защите растений от сельскохозяйственных вредителей играют биологические методы борьбы с использованием препаратов, полученных на основе вирусных, бактериальных и грибных патогенов или синтезируемых ими продуктов. Преимущество большинства известных микробиологических средств защиты растений по сравнению с химическими - их экологическая безопасность.

Наиболее широко в качестве микробиологических средств защиты растений используют продукты на основе различных штаммов энтомопатогенной бактерии Bacillus thuringiensis. Эти бактерии при споруляции синтезируют кристаллические белки, или, как их еще называют, дельта-эндотоксины, отличающиеся между собой по спектру энтомопатогенного действия [2]. Дельта-эндотоксины обладают избирательным токсичным действием только по отношению к насекомым.

Некоторые штаммы Bacillus thuringiensis продуцируют еще и термостабильный экзотоксин, который в отличие от эндотоксина не обладает избирательностью и проявляет токсичность в отношении очень широкого круга беспозвоночных и позвоночных животных, вызывая также аллергические реакции у лиц, работающих с этими препаратами [3].

Известны штаммы Bacillus thuringiensis, которые обладают инсектицидной активностью против представителей как отряда Coleoptera, так и отряда Lepidoptera [4, 5]. Однако они не токсичны для представителей отрядов Homoptera, Thysanoptera (инсектицидная активность) и Acariformes (акарицидная активность).

Известен штамм бактерий Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715, обладающий инсектоакарицидной активностью против представителей отрядов Lepidoptera, Coleoptera, Homoptera, Thysanoptera и Acariformes [6]. Штамм выбран нами в качестве прототипа.

Задача полученного изобретения - получить штамм бактерий Bacillus thuringiensis, с повышенной микробиологической продуктивностью и инсектоакарицидной активностью.

Задача решена путем селекции штамма бактерий Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715 на лабораторных и промышленных питательных средах. При многосчисленных пересевах и рассевах до единичных колоний был получен штамм Bacillus thuringiensis БИОС-1, обладающий повышенной инсектоакарицидной активностью против листогрузущих и сосущих вредителей.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как Bacillus thuringiensis БИОС-1 ВКПМ В-10709.

Штамм ВКПМ В-10709 имеет следующие хактеристики:

Культурально-морфологические признаки.

Грамположительные подвижные палочки размером 4,1-1,6 мкм. В стационарной фазе роста образуют кристаллы эндотоксинов и овальные споры.

Хорошо растет на гидролизатах казеина (панкреатический гидролизат казеина - 1, дрожжевой экстракт - 0,2, MnSO₄, - 0,5, MgSO₄ - 3, KH₂PO₄ - 0,1, глюкоза - 0,6, вода - остальное, pH среды - 7,4-7,5, состав среды в мас.%) при 27-29°С и pH 6,8-7,5. На агаризованной среде казеина (панкреатический гидролизат казеина - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, хлористый натрий - 0,05, агар - 1,5, вода - остальное, pH среды - 7,4-7,5, состав среды в мас.%) на 10 сутки при 27-29°С образует однородные колонии 3-5 мм в диаметре, светло-серого цвета со слабо изрезанным краем. Структура мелкозернистая.

По Н-антигену относится к сероварианту III (3а3в).

При культивировании штамма как в жидких, так и на твердых питательных средах выхода фага не наблюдается.

Физиолого-биохимические признаки.

Отношение к источникам углерода: усваивает с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, кукурузный и картофельный крахмал, соевую и кукурузную муку. Не усваивает лактозу, ксилозу, арабинозу, лецитин. Пептонизирует молоко, гидролизует крахмал, желатину не разжижает.

Отношение к источникам азота: восстанавливает нитраты, усваивает аммонийные формы азота.

Отношение к температуре: хорошо растет при 27-29°С, оптимальная температура 28°С.

Отношение к pH среды: хорошо растет при 6,8-7,5, оптимум рН-7,2. Отношение к кислороду: аэроб.

Отношение к фагам: устойчив к основным производственным фагам П, 22, С/П, И-77, 25-16.

Бета-экзотоксин не синтезирует.

Не патогенен для человека, домашних и диких животных, полезных насекомых, птиц и рыб.

Не является генетически модифицированным штаммом.

Заявляемые свойства: синтезирует компоненты, обладающие инсектоакарицидной активностью против представителей отрядов Lepidoptera, Coleoptera, Homoptera, Thysanoptera и Acariformes.

Маркерные признаки: активность против представителей отрядов Lepidoptera, Coleoptera, Homoptera, Thysanoptera и Acariformes, отсутствие способности синтезировать бета-экзотоксин.

Хранение штамма: штамм хранят в ампулах после лиофилизации спорокристаллической смеси обычным способом.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР 1. Микробиологическая продуктивность полученного штамма.

Оценку микробиологической продуктивности полученного штамма Bacillus thuringiensis БИОС-1 ВКПМ В-10709 на лабораторных питательных средах проводили по двум основным параметрам, а именно титру спор и концентрации основного инсектицидного белка (дельта-эндотоксина) в сравнении с прототипом, штаммом Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715.

Для этого штаммы Bacillus thuringiensis выращивали в колбах емкостью 750 мл в объеме среды выращивания 200 мл до стадии полной споруляции на круговой качалке при 28°С и встряхивании 250 об/мин. Для выращивания использовали среды следующего состава, мас.%:

1. Среда 1:

Панкреатический гидролизат казеина 1 Дрожжевой экстракт 0,2 MnSO₄, 0,5 MgSO₄ 3, KH₂PO₄ 0,1 Глюкоза 0,6, Вода остальное pH среды 7,4-7,5

2. Среда 2:

Триптический гидролизат казеина 1 Дрожжевой экстракт 0,2 MnSO₄ 0,5 MgSO₄ 3, KH₂PO₄ 0,1 Глюкоза 0,6, Вода остальное pH среды 7,4-7,5

3. Среда 3:

Пептон 1 Дрожжевой экстракт 0,2 MnSO₄, 0,5 MgSO₄ 3 KH₂PO₄ 0,1 Глюкоза 0,6, Вода остальное pH среды 7,4-7,5

Выращенную культуру отделяли центрифугированием и отмывали 1М NaCl в присутствии 0.001М ЭДТА. Кристаллические белки из спорокристаллической смеси растворяли в карбонатном буфере pH 11,0 в течение часа, не растворившийся осадок отделялся центрифугированием, pH надосадочной жидкости доводили до 10,0. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорда [7], используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта. Полноту растворения контролировали повторной экстракцией в том же буфере. При повторной экстракции растворялось не более 7% белка. Определение титра жизнеспособных спор проводили на чашках Петри с агаризованной средой следующего состава, мас.%:

Панкреатический гидролизат казеина 1 Дрожжевой экстракт 0,5 Хлористый натрий 0,05 Агар 1,5 Вода остальное pH среды 7,4-7,5

Результаты исследований приведены в таблице 1:

Таблица 1 Питательные среды Среда 1 Среда 2 Среда 3 Штаммы Bacillus thuringiensis ВКПМ
В-8715 ВКПМ
В-10709 Вкпм
В-8715 ВКПМ
В-10709 ВКПМ
В-8715 ВКПМ
В-10709 Титр спор, ×10⁸ на мл 4,5 6 1,8 2,6 3,5 5,0 Концентрация белка (мг/мл) 0,25 0,4 0,35 0,5 0,25 0,4

Как следует из таблицы 1, полученный штамм Bacillus thuringiensis БИОС-1 ВКПМ В-10709 на трех исследованных лабораторных питательных средах превосходит по микробиологической продуктивности (титр спор, концентрация основного инсектицидного белка, дельта-эндотоксина) штамм Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМВ-8715 (прототип) на 25-30%.

Оценку полученного штамма на промышленной питательной среде проводили по параметру микробиологической продуктивности как титр спор.

Для подготовки посевного материала полученный штамм и прототип выращивали в 2 мл среды 1 в течение 12 часов при 28°С, как было описано выше. Затем 1 мл микробной культуры засевают в колбы емкостью 750 мл с объемом среды выращивания 50 мл дрожже-полисахаридной среды (ДПС) следующего состава, мас.%: дрожжи кормовые - 36, кукурузная мука - 26,8, соевая мука - 5,0, мел - 3,0, вода - остальное, pH среды - 7,2-7,5 и культивировали на круговой качалке до стадии полной споруляции. Определение титра жизнеспособных спор проводили на чашках Петри с агаризованной средой как описано выше. Результаты опыта приведены в таблице 2.

Таблица 2 Штаммы ВКПМ ВКПМ. Bacillus thuringiensis В-8715 В-10709 Микробиологическая продуктивность(млрд. сп./мл) 4,3 6,0

Из результатов, приведенных в таблице 2, следует, что продуктивность полученного штамма Bacillus thuringiensis БИОС-1 ВКПМ В-10709 на промышленной среде выше продуктивности штамма Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715 (прототип).

Микробиологическая продуктивность (титр спор, концентрация основного инсектицидного белка, дельта-эндотоксина) полученного штамма Bacillus thuringiensis БИОС-1 ВКПМ В-10709 на лабораторных питательных средах и промышленной питательной среде выше, чем у штамма-прототипа (Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715).

ПРИМЕР 2. Оценка инсектоакарицидной активности полученного штамма.

Определение инсектоакарицидной активности полученного штамма Bacillus thuringiensis БИОС-1 ВКПМ В-10709 и прототипа Bacillus thwingiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715 былоо проведено на представителях отрядов Lepidoptera, Coleoptera, Homoptera, Thysanoptera и Acariformes в лабораторных условиях.

Полученный штамм ВКПМ В-10709 и прототип ВКПМ В-8715 выращивали до стадии полной споруляции как в примере 1 на среде 1.

Оценку инсектицидной активности для представителей отряда Lepidoptera проводили на двух объектах: гусеницах непарного шелкопряда Lymantria dispar 2 возраста и гусеницах мельничной огневки Galleria mellonella 7 возраста.

Гусениц непарного шелкопряда выращивали из хранящихся в холодильной камере при температуре +4°С яйцекладок на среде следующего состава, мас.%:

Семена фасоли набухшие 72 Дрожжи пивные сухие 5,4 Агар 5,4 Бумага фильтровальная мелко нарезанная 2 Сахароза 4 Калий фосфорно-кислый двузамещенный 1,4 Аскорбиновая кислота 1,4 Масло льняное 0,7 Бензойная кислота + спирт 3,5 Формалин (40%) 1,8 КОН 1,4 Лист дуба сухой (измельченный) 1

При биотестировании 3 г среды смешивали с 1 мл испытуемой суспензии споро-кристаллической смеси (дважды отмыты физраствором) и хорошо растирали смесь в фарфоровой ступке с помощью пестика. Полученную смесь шпателем переносили на крышку чашки Петри и размещали в виде кольца диаметром около 3 см. Внутрь этого кольца сажали по десять гусениц. На дно чашки Петри помещали диск фильтровальной бумаги. Каждый образец суспензии испытывали в 3-х параллельных повторностях. Эксперимент проводили при комнатной температуре и естественном освещении. Число погибших насекомых подсчитывали на 6-й день. Результаты опыта приведены в таблице 3.

Таблица 3 Штаммы Bacillus thuringiensis Смертность (%) непарного шелкопряда (Lepidoptera, Lymantria dispar) ВКПМ В-8715 60 ВКПМ В-10709 75

Полученный штамм Bacillus thuringiensis БИОС-1 ВКПМ В-10709 по инсектицидной активности против непарного шелкопряда превосходит прототип Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715 на 25%.

Оценку инсектицидной активности против мельничной огневки (Galleria mellonella) 7 возраста проводили методом подсадки личинок мельничной огневки в чашки Петри с кормом (мерва + пшеничные отруби).

Корм расфасовывали в чашки Петри (по 9 г в каждую), в которые вносили по 3 мл препарата.

В каждую чашку Петри (после подсыхания корма) подсаживали по 10 гусениц огневки 7 возраста (массой 75±5 мг) в трех повторностях. Чашки Петри с гусеницами содержали на лабораторных столах при температуре воздуха 25±20°С и относительной влажности воздуха 60-80%. Гибель гусениц подсчитывали на 6 сутки. Результаты опыта приведены в таблице 4.

Таблица 4 Штаммы Bacillus thuringiensis Смертность (%) мельничной огневки (Lepidoptera, Galleria mellonella) ВКПМ В-8715 30 ВКПМ В-10709 39

Полученный штамм Bacillus thuringiensis БИОС-1 ВКПМ В-10709 по инсектицидной активности против мельничной огневки превосходит прототип Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715 на 30%.

Оценку инсектицидной активности полученного штамма ВКПМ В-8715 для представителей отряда Coleoptera проводили на личинках колорадского жука Leptinotarsa decemlineata.

Личинок колорадского жука младшего возраста (3 и начало 4 возраста) подсаживали в чашки Петри с листьями картофеля, обработанными путем погружения в растворы препаратов. В таблице 5 приведены результаты учета гибели личинок колорадского жука на 5-е сутки.

Таблица 5 Штаммы Bacillus thuringiensis Смертность (%) колорадского жука (Coleoptera, Leptinotarsa decemlineata) ВКПМ В-8715 72 ВКПМ В-10709 88

Полученный штамм Bacillus thuringiensis БИОС-1 ВКПМ В-10709 по инсектицидной активности против личинок колорадского жука превосходит прототип Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ В-8715 на 25%.

Сравнительную оценку инсектоакарицидной активности полученного штамма против представителей отрядов Homoptera, Thysanoptera и Acariformes проводили на трех объектах: бахчевая тля, западный цветочный трипс и паутинный клещ.

Для тест-объектов в лабораторных условиях использовали метод погружения растений-хозяев в растворы культуральной жидкости со спорами и кристаллами исследуемых штаммов, полученные после окончания споруляции как в примере 1 на среде выращивания 1.

Для бахчевой тли (Aphis gossypii Glov., Homoptera) срезанные листья огурца погружали в растворы испытуемых образцов на 6 секунд, после чего их помещали на влажную фильтровальную бумагу в чашку Петри и заселяли самками тли.

Для западного цветочного трипса (Frankliniella occidentalis Pergande, Thysanoptera) использовали двухлистковые растения фасоли. За 7 дней до опыта на растения самки трипса откладывали яйца. После отрождения личинок растения срезали и листьями погружали в растворы испытуемых образцов на 6 секунд, после чего устанавливали в стаканы с водой, подставляя под черешки пластмассовые кружки, обмазанные по краям вазелином.

В случае обыкновенного паутинного клеща (Tetranychus urticae Koch, Acariformes) срезанные двухлистковые растения фасоли за сутки до опыта заселяли самками клеща. Растения погружали в растворы препаратов на 6 секунд и устанавливали в сосуды с водой.

Результаты гибели тест-объектов на 5-е сутки приведены в таблице 6.

Таблица 6 Штаммы Bacillus thuringiensis ВКПМ B-8715 ВКПМ В-10709 Смертность (%) бахчевой тли (Homoptera, Aphis gossypii Glov.,) 55 69 Смертность (%) паутинного клеща (Acariformes, Tetranychus urticae Koch,) 79 95 Смертность (%) западного цветочного трипса (Thysanoptera, Frankliniella occidentalis Pergande,) 49 61

Как следует из результатов, представленных в таблице 6, полученный штамм Bacillus thuringiensis БИОС-1 ВКПМ В-10709 по инсектоакарицидной активности против представителей отрядов Homoptera, Thysanoptera и Acariformes превосходит прототип Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ B-8715 на 20-25%.

Инсектоакарицидная активность полученного штамма Bacillus thuringiensis БИОС-1 ВКПМ В-10709 против представителей отрядов Lepidoptera, Coleoptera, Homoptera, Thysanoptera и Acariformes превосходит прототип Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki ВКПМ B-8715 на 20-30%.

Источники информации

1. National Research Council. 1986. Pesticide reistance: strategies and tactics for management. National Academy of Sciences, Washington, D.C.

2. Crickmore, N., Zeigler, D.R., Feitelson J., Schenepf, E., van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J. and Dean, D.H. 1998. Revision of the nomenclature for Bacillus thuringienis pesticidal crystal proteins. Microbiol. Molec. Biol. Rev. 62:807-813.

3. McConnell, E. and Richards, A.G. 1959. The production by Bacilllus thuringiensis Berliner of a heat-stable exotoxin toxic to insects. Can. J. Microbiol. 5: 161-168.

4. USA patent 6,156,308.

5. Патент РФ №2125091.

6. Патент РФ №2278159.

7. Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt. Biochem. 72: 248-254.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве бактериальных препаратов. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis БИОС-1 ВКПМ В-10709, обладающий инсектоакарицидной активностью против представителей листогрызущих и сосущих вредителей, таких как представители отрядов Lepidoptera, Coleoptera, Homoptera, Thysanoptera и Acariformes, приносящих вред сельскохозяйственным культурам, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ФГУП ГосНИИгенетика под номером В-10709. Изобретение позволяет повысить смертность представителей листогрызущих и сосущих вредителей, приносящих вред сельскохозяйственным культурам. 6 табл.

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis БИОС-1 ВКПМ В-10709, обладающий инсектоакарицидной активностью против представителей листогрызущих и сосущих вредителей.