СПОСОБ ХРАНЕНИЯ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2002 года по МПК C12N1/04 C12N1/00 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к ее отраслям бактериологии и микологии, связанным с культивированием и хранением микроорганизмов на синтетических питательных средах, и может быть использовано для увеличения сроков хранения мицелиальных и бактериальных культур, используемых для синтеза биологически активных веществ в микробиологической промышленности, а также в ходе производства посевного мицелия в грибоводческих хозяйствах.

Известен способ хранения микроорганизмов в физиологическом растворе с добавлением волокон капрона или полипропилена (лавсана, вискозы) в качестве гидрофобных объектов [Патент РФ 2008348, С 12 N 1/04, 1994. Афиногенов Г.Е., Доморад А.А., Шамолина И.И., Краснова М.В. Способ хранения микроорганизмов]. Недостатком способа является его узкая направленность: метод может применяться лишь в отношении грамположительных аэробов, спорообразующих бактерий и грибов рода кандида.

Предложены составы для консервации микроорганизмов путем замораживания, включающие в качестве криопротекторов растворы сахарозы или глицерина [Патент РФ 2088656, С 12 N 1/04, 1997. Плотников О.П., Маркова Л.И., Виноградова Л.А., Харченко В.Г., Казаринова Т.Д. Состав для хранения бактерий], к недостаткам которых можно отнести узкий спектр применения; составы лиофильных сред [Методы общей бактериологии. / Под ред. Ф. Герхардта. М., 1983, т. 1б, с. 535], недостатки - возможные утраты полезных свойств штамма. Общими недостатками указанных методов являются необходимость специального оборудования, необходимость мер предосторожности при проверке герметичности стеклянных ампул. Кроме того, известны факты изменения структуры и свойств хранящегося материала вплоть до потери отдельных признаков. В связи с этим данные методы непригодны для хранения продуцентов и тем более мицелия высших грибов.

Известен способ хранения штаммов микроорганизмов на твердых питательных средах под слоем минерального масла [Методы общей бактериологии. / Под ред. Ф. Герхардта. М. , 1983, т. 1б, с. 535]. В основе указанного способа лежит ограничение доступа атмосферного кислорода к микроорганизмам, что снижает уровень обмена веществ и позволяет хранить многие штаммы без пересева в течение длительного времени. Недостатком указанного способа является то, что микроорганизмы, хранившиеся под слоем масла, нередко теряют способность к росту, использованию питательных субстратов и снижают продуктивность.

Наиболее близким по технологической сущности к заявляемому изобретению является метод хранения культур при систематических пересевах [Промышленная микробиология. / Под ред. Н.С. Егорова. М., 1989, с. 149-167]. Суть указанного метода заключается в том, что по истечении определенного промежутка времени (как правило, не более месяца) хранящиеся культуры микроорганизмов пересевают на свежие питательные среды. Однако при частых пересевах продуценты нередко теряют способность к выработке целевых продуктов или снижают ее. Среди прочих причин это обусловлено спонтанной диссоциацией штаммов, инициируемой окислительными стрессами, являющимися обязательным последствием процессов многократного пересева. Кроме того, недостатками этого метода считаются возможность заражения, краткосрочность хранения, трудоемкость работы и расход в больших количествах материалов, входящих в состав питательных сред.

Предлагаемый нами метод хранения микроорганизмов свободен от этих недостатков и отличается меньшей трудоемкостью, экономичностью, а также не изоляцией микроорганизмов от атмосферного кислорода, а организацией их лучшей антиоксидантной защиты.

Поставленная цель достигается введением в питательную среду ультранизких доз селената натрия. Содержащийся в нем микроэлемент селен способен увеличивать активность практически всех звеньев антиоксидантной системы микроорганизмов без негативного воздействия на ферментативный аппарат. Это позволяет не только сохранить все позитивные свойства организмов в течение длительного периода времени без пересева, но и в ряде случаев увеличить их.

Другим признаком, выгодно отличающим предлагаемый способ хранения микроорганизмов от известных, является то, что внесение в среду сверхнизких доз селеновой соли практически не вызывает никаких дополнительных затрат.

Настоящее изобретение направлено на решение задачи увеличения сроков хранения культур микроорганизмов, без многократных пассажей, требующих затрат материалов, рабочей силы и энергии. Другой важной задачей, которую успешно решает предлагаемое изобретение, является сохранение всех необходимых параметров хранящейся культуры в течение длительного времени.

Для решения задачи в любую питательную среду, предназначенную для хранения бактериальной или мицелиальной культуры (рецептура сред определяется видом микроорганизма), вносят раствор селената натрия (Na₂SeO₄) в концентрации 1•10^-2 г/л с тем расчетом, чтобы конечная концентрация в питательной среде составляла 1•10^-4-10^-6 г/л.

Особенность изобретения состоит в том, что увеличение сроков хранения жизнеспособной культуры достигается без изменения состава регламентированной питательной среды, причем в данном случае практически не требуется дополнительных экономических затрат в связи с тем, что необходимое количество вносимого вещества (селенат натрия) очень мало.

Пример 1.

Для решения задачи в отношении ряда микромицетов в 1000 мл приготовленной синтетической питательной среды для хранения продуцентов (среду Райстрика, содержащую сахарозу 1,5%, глицерин 1,5%, натрий хлористый 0,5%, калий хлористый 0,05%, пептон 0,6%, магний сернокислый 0,005%, сульфат меди 0,002%, сульфат марганца 0,00002%, калий фосфорнокислый однозамещенный 0,03%, сульфат железа 0,0015% и агар-агар 2%) вносили стерильной пипеткой 10 мл раствора селената натрия в концентрации 1•10^-2 г/л, чтобы конечная концентрация составила 10^-4-10^-6 г/л. Обогащенная селеном питательная среда стерилизовалась в автоклаве при обычном режиме (при температуре 120^oС и давлении 1 атм в течение 1,5 часов). Стерильную питательную среду охлаждали до температуры 38^oС и в стерильных условиях разливали в чашки Петри, куда после застывания субстрата инокулировали посевной материал. Рост микроорганизма осуществлялся в течение 12-14 суток, после чего культуры помещались в условия холодильника.

Пример 2.

При работе с продуцентами - актиномицетами (на примере Streptomyces flavochromogenes - продуцента гелиомицина) использовали среду Гаузе следующего состава: калий азотнокислый 0,1%, крахмал картофельный 2%, калий фосфорнокислый двузамещенный 0,05%, натрий хлористый 0,05%, магний сернокислый 0,05%, железо сернокислое закисное 0,001%, агар-агар 3%. Манипуляции производили и вносили соединение селена по аналогии с примером 1.

Пример 3.

При работе с бактериальными продуцентами (Bacillus subtilis - продуцент рибоксина) в качестве среды для поддержания и хранения использовался белково-витаминный агар следующего состава: натрий хлористый 0,5%, пептон 1%, глюкоза 1%, агар-агар 2,5% и гидролизат белково-витаминного концентрата - 95%.

Манипуляции производили и вносили соединение селена по аналогии с примером 1.

Пример 4.

В отношении высших грибов в качестве испытуемого объекта использовался промышленный штамм шампиньона двуспорового Agaricus bisporus, предназначенный для культивирования в грибоводческих хозяйствах. Штаммы шампиньона сохраняют на агаризованной среде, содержащей овсяный экстракт (агар-агар 3%, экстракт овса 30%, дистиллированная вода до 1 л).

Манипуляции производили и вносили соединение селена по аналогии с примером 1.

Во всех указанных случаях культуры сохранили способность к прорастанию в обычные сроки после хранения на средах с добавлением указанных концентраций селената натрия (в течение 3 и 6 месяцев). После 6 месяцев хранения культуры на таких средах сроки прорастания спор продуцентов стали меняться (табл.1). Аналогичные показатели получены при изучении последствий хранения мицелиальных культур в течение указанных выше сроков в отношении ферментативной активности продуцентов. В процессе хранения культур на обычной среде свыше 1 месяца их ферментативные способности последовательно угасают (табл.2). После 6 месяцев хранения такие культуры не брались в опыт по причине того, что посевной материал практически утратил способность к прорастанию.

У промышленного штамма шампиньона после хранения на обогащенной селеном среде обнаружены хорошие показатели роста посевного мицелия и урожайности (табл.3).

Изобретение относится к микробиологии, а именно культивированию и хранению микроорганизмов на синтетических питательных средах. Позволяет увеличить сроки хранения мицелиальных и бактериальных культур-продуцентов биологически активных веществ. Актуально в ходе производства посевного мицелия в грибоводческих хозяйствах. Внесение в питательную среду, предназначенную для хранения бактериальной или мицелиальной культуры, водного раствора селената натрия (Na₂SeO₄) с конечной его концентрацией 10^-4-10^-6 г/л среды способствует сохранению всех необходимых параметров хранящейся культуры в течение длительного времени без пересева. 3 табл.

Способ хранения культур микроорганизмов на стандартных, предназначенных для сохранения культур плотных средах, индивидуальных для конкретных объектов, отличающийся тем, что для обеспечения сохранности микробных культур в питательную среду вносят водный раствор селената натрия с таким расчетом, чтобы его конечная концентрация составляла 1•10^-4-1•10^-6 г/л среды.