ДИПЛОИДНЫЙ ШТАММ ASPERGILLUS NIGER - ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2003 года по МПК C12P7/48 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/685 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается диплоидного штамма гриба Aspergillus niger - продуцента лимонной кислоты для ферментации глубинным способом углеводсодержащих сред.

Известен штамм гриба Aspergillus niger ВКПМ F-681, который был получен под воздействием УФ-лучей методом ступенчатой селекции из черноокрашенного мутанта гриба 163/9. Для стабилизации свойств селекционированных мутантов проводился отбор устойчивых спонтанных вариантов. Устойчивость морфолого-культуральных и физиолого-биохимических свойств у селекционированного штамма позволила использовать его в качестве продуцента лимонной кислоты при ферментации сахарозо-минеральных сред, гидролизата крахмала. Выход лимонной кислоты составил соответственно: % от введенного сахара 89,0 и 92,5, а в г на 1 г воздушно-сухого мицелия 18,7 и 12,0 /1/.

Однако при хранении штамма ВКПМ F-681 отмечено увеличение морфологической изменчивости колоний до 7%; у спонтанных вариантов этого штамма наблюдались большие колебания по выходу лимонной кислоты.

Многолетние исследования по применению метода мутагенеза показали, что значительное возрастание продуктивности у мутантных штаммов достигается на первых этапах селекции, на последующих ступенях селекции метод мутагенеза менее эффективен. Поэтому для селекции новых продуцентов лимонной кислоты был использован неприменяемый в настоящее время в селекции Aspergillus niger метод полиплоидии.

Прототипом изобретения является митотический диплоидный штамм Asp.niger 2В-1-10 /2/, селекционированный методом полиплоидии под влиянием митозного яда d-камфоры из гаплоидного штамма ВКПМ F-681. Вначале под воздействием камфоры была получена полиморфная культура Д-4. Селекцию диплоидной культуры из популяции полиморфной культуры проводили ступенчато. Для обогащения культуры диплоидными клетками применяли фильтрационный метод и облучение летальной для гаплоидного штамма дозой УФ-лучей (6 кДж/м²).

Морфология колонии митотического диплоида 2В-1-10.

Гигантская колония на сусло-агаре складчатая, опушенная, конидиальные головки крупнее, чем у исходного штамма. Конидиеношение черное, обильное.

Диаметр конидиальной головки 200-300 мкм.

Диаметр вздутия конидиеносца 39-47 мкм.

Длина стеригм первого слоя 21-39 мкм.

Длина стеригм второго слоя 9 мкм.

Диаметр конидий 5 мкм.

Число конидий в 1 г посевного материала 11,4•10⁹.

Масса 1 конидии 8,8•10^-8 мг.

Микроскопические структуры диплоида крупнее, чем у исходного штамма в 1,5-2,0 раза.

Масса одной конидии больше в 1,7 раза.

В работе авторов /2/ приведены данные по активности диплоидного и исходного гаплоидного штаммов в опытах по ферментации сахарозо-минеральной среды и гидролизата крахмала. На этих средах конидии диплоида набухают, увеличиваясь в диаметре до 10-27 мкм, у исходного штамма до 6-9 мкм. Ростковые трубки у диплоида в 1,5-2,0 раза больше по диаметру, чем у исходного штамма. Из проросших конидий формируются мицелиальные гранулы. У исходного штамма гранулы плотные с длинными периферическими гифами; у диплоида гранулы крупные рыхлые с короткими периферическими гифами.

При ферментации на сахарозо-минеральной среде через 5 сут выход лимонной кислоты у диплоида выше в среднем на 18%, чем у гаплоида. Конверсия сахара в лимонную кислоту составляет 91-100%. Рост мицелия у диплоида меньше, чем у гаплоидов и составляет 0,5-0,3 г воздушно-сухого мицелия (ВСМ). Незначительный рост митотического диплоида на сахарозо-минеральной среде не позволяет получить достаточно стабильные результаты по выходу лимонной кислоты.

Митотический диплоид после селекционирования хранился в виде воздушно-сухих конидий при 20^oС. После 1,5 лет хранения только 70% колоний сохранили исходный фенотип.

Кроме того, в статье не упоминаются сведения относительно образования лимонной кислоты при ферментации диплоидом мелассных сред.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является новый штамм гриба Aspergillus niger - продуцент лимонной кислоты, имеющий стабильно высокую продуктивность.

Способ селекции нового штамма. Исходным для получения штамма служил известный митотический диплоидный штамм Asp.niger 2B-1-10.

Конидии исходного штамма 2В-1-10 были подвергнуты воздействию УФ-лучей в дозе 6 кДж/м, при котором выживаемость конидий у черноокрашенного диплоидного штамма составляет 0,1%; у черноокрашенного гаплоидного штамма ВКПМ F-681 - 0,02%. Облучение позволило устранить из популяции исходного штамма гаплоидные клетки и получить мономорфную диплоидную культуру.

После облучения дозой 6 кДж/м² было отобрано 30 культур. При ферментации сахарозо-минеральной среды 7 культур из 30 продуцировали от 5,18 до 7,80 г лимонной кислоты на колбу, при этом выход воздушно-сухого мицелия на колбу составил 0,29-0,55 г, продуктивность мицелия (12,2-18,8) г ЛК/г ВСМ.

Из популяции рекомбинантов первого поколения селекционирована морфологически однородная культура. Ее рост на сахарозо-минеральной среде улучшился и составил 0,82 г ВСМ на колбу; продуктивность мицелия составила 10,2 г ЛК/г ВСМ. Новому селекционированному штамму Aspergillus niger во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов присвоен коллекционный номер ВКПМ F-817.

Культурально-морфологические свойства Aspergillus niger штамма ВКПМ F-817. На 2 сутки роста на сусло-агаре образуется колония диаметром 16 мм, белая пушистая аконидиальная. На 5 сутки величина колонии 81 мм. Конидиеношение темно-серое, "стерильный" край 7,5 мм. На 10 день формируются конидиальные головки величиной 182-334 мкм. Диаметр вздутия конидиеносца 36-47 мкм. Длина стеригм первого слоя 22-43 мкм; второго слоя 9,0 мкм. Средний диаметр конидий 4,9 мкм и объем конидии 61,6 мкм³.

По сравнению с исходным штаммом 2В-1-10 у рекомбинанта в результате облучения и отбора несколько уменьшилась величина конидий и их масса.

Сравнительная характеристика штаммов представлена в табл. 1.

Генетическая особенность. Штамм ВКПМ F-817 слабо растет на минеральных средах. Внесение в питательные среды органических добавок усиливает рост и конидиеобразование.

Добавление в сахарозо-минеральную среду свекловичной мелассы в количестве 17 г/дм³ среды улучшает формирование гранул мицелия гриба; добавление в сусло-агаровую среду автолизата хлебопекарных дрожжей в дозе 50 см³/дм³ среды усиливает созревание конидий. Дрожжевой автолизат является источником витаминов и нуклеиновых оснований, что позволяет считать, что новый штамм ВКПМ F-817 является частично дефицитным.

Физиолого-биохимические свойства. Asp.niger штамм ВКПМ F-817 аэроб, температура культивирования 28-32^oС, рН 5,5-7,5.

Отношение к источникам углерода: усваивает глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, декстрины; в меньшей степени маннит, яблочную и янтарную кислоты, водные растворы таннина.

Отношение к источникам азота: усваивает азот органических соединений, например белок, пептон, соли аммония, нитриты, аминокислоты, дрожжевой автолизат.

Устойчивость при хранении. Диплоидный штамм Asp.niger ВКПМ F-817 селекционирован в 1998 году. При хранении в виде воздушно-сухих конидий с крупным стерильным кварцевым песком свои свойства сохраняет. Выдерживает пересевы на сусло-агаровой среде: после двух пересевов изменчивость морфологии колонии составляет 0,4%, после четырех пересевов - 2,0%.

Размножению конидий с целью получения посевного материала предшествует отбор спонтанных вариантов из типичной колонии.

Диплоидный штамм - ВКПМ F-817 является высокоактивным продуцентом лимонной кислоты при ферментации углеводсодержащих сред - из свекловичной мелассы, сахарозо-минеральной и гидролизата крахмала.

Практическая полезность рекомбинанта митотического диплоида иллюстрируется рядом примеров.

Пример 1
Испытанию на разбавленной среде из свекловичной мелассы подвергнут посевной материал культуры митотического диплоида 2В-1-10, рекомбинанта диплоида ВКПМ F-817 и гаплоидного штамма ВКПМ F-681.

Для ферментации среды из свекловичной мелассы приготавливается посевной материал в виде воздушно-сухих конидий, содержащих 15•10⁹ конидий в 1 г посевного материала. Посевной материал выращивается на среде состава (г/дм³): сусло пивное неохмеленное 8^o Блг, хлорид натрия 10, мочевина 1, медь сульфат пентагидрат 0,02, агар 20, рН 5,6.

Среда стерилизуется при 0,07 МПа 30 мин и в стерильном боксе наливается высотой слоя 11 мм в заранее простерилизованные при 0,1 МПа кюветы.

Засеянные кюветы помещают в термостат с температурой 32^oС и относительной влажностью 60%. В течение 8 сут формируются зрелые конидии и подсушивается пленка гриба. На 8-9 сутки сбор конидий производится при помощи вакуумного сборника или шпателем.

Процесс ферментации проводится в глубинных условиях на качалке АВУ-50р с числом колебаний 160 в минуту в колбах емкостью 750 см³ при температуре в термостате 32^oС.

В качестве источника углерода применяется свекловичная меласса, содержащая 44,67% сахарозы.

Ферментацию осуществляют в две стадии. На первой стадии в 50 см³ разбавленной мелассной среды (30 г сахара в 1 дм³) из конидий гриба выращивают гранулы мицелия.

Состав среды, г/дм³:
Меласса свекловичная - 67,07
Калий гексацианоферрат тригидрат - 0,2
Аммоний оксалат моногидрат - 1,43
Калий дигидрофосфат - 0,16
Магний сульфат гептагидрат - 0,25
Через сутки 10 см³ питательного раствора с мицелиальными гранулами переносят в 50 см³ ферментационной среды того же состава, за исключением сульфата магния; доза оксалата аммония была уменьшена вдвое.

На вторые сутки производят долив концентрированного раствора мелассы (559 г мелассы в 1 дм³), подвергнутой обработке гексацианоферратом калия и стерилизации.

Для сравнения в тех же условиях выращивают исходный штамм ВКПМ F-681 и исходный диплоидный штамм 2В-1-10. В течение суток конидии набухают: от 5,0 мкм до 16-20 мкм у митотического диплоида 2В-1-10, от 4,9 мкм до 16-18 мкм у рекомбинанта ВКПМ F-817, от 3,9 мкм до 11-16 мкм у гаплоидного штамма ВКПМ F-681. Ширина проростков у диплоида 2В-1-10 - 5,3 мкм; у рекомбинанта 4,6 мкм; у родительского штамма ВКПМ F-681 - 4,0 мкм.

На ферментационной среде в течение 6 суток у диплоидных штаммов формируются рыхлые гранулы. У исходного диплоида диаметр гранул 800 мкм, у рекомбинанта - 700 мкм, у гаплоидного штамма - 600 мкм.

У гаплоидного штамма ВКПМ F-681 гранулы плотные.

Результаты испытания на разбавленной мелассной среде представлены в табл.2 в примере 1.

Как можно видеть из данных таблицы наиболее высокий выход лимонной кислоты от сахара мелассы получен у диплоидного рекомбинантного штамма ВКПМ F-817, он составил 87%, в то время как у исходного штамма 2В-1-10 выход лимонной кислоты 78%.

Пример 2
Испытанию на концентрированной среде из свекловичной мелассы подвергнут посевной материал культуры митотического диплоида 2В-1-10, рекомбинанта диплоида ВКПМ F-817 и гаплоидного штамма ВКПМ F-681. Посевной материал для биохимического опыта приготавливают по способу, описанному в примере 1.

Подготовка среды для ферментации отличается использованием мелассной среды, содержащей 130 г/дм³ сахара в исходной среде. В процессе ферментации дополнительные доливы мелассной среды не проводятся. Остальные условия испытания аналогичны примеру 1.

Окончание опыта произведено на 4 сутки ферментации.

Результаты проверки диплоидных культур - митотического диплоида 2В-1-10, рекомбинанта диплоида ВКПМ F-817 и гаплоидного штамма ВКПМ F-681 представлены в табл.2 примера 2.

У диплоидного рекомбинантного штамма выход лимонной кислоты от сахара достигает 66%, у исходного диплоидного штамма 59%.

Пример 3
Для ферментации сахарозо-минеральной среды посевной материал штамма ВКПМ F-817 выращивают по способу, описанному в примере 1.

Определение продуктивности проводится методом погруженной культуры на качалке АВУ-50р.

Ферментация проводится в две стадии. На первой стадии выращивается посевной мицелий (гранулы) на среде состава (г/дм³): сахар 50, меласса свекловичная 17, нитрат аммония 2,5, сульфат магния гептагидрат 0,25, дигидроортофосфат калия 0,16, рН 6,9. Посевной мицелий выращивался в течение 2 суток.

На второй стадии ферментации применяют среду того же состава, как и для выращивания гранул мицелия, но отличающуюся увеличенным до 150 г/дм³ содержанием сахара. В 55 см³ ферментационной среды вносят 10 см³ питательной среды с мицелиальными гранулами.

Длительность ферментации составляет 5 сут. Результаты опыта представлены в табл.2 примера 3. Как видно из данных в табл.2, из двух диплоидных культур доминирует рекомбинант ВКПМ F-817. Выход лимонной кислоты от сахара у диплоида 2В-1-10 - 94,8%, у рекомбинанта 95,6%. Более обильный рост мицелия у рекомбинантного штамма не снижает выход лимонной кислоты и создает большую устойчивость к изменяющимся внешним факторам (относительная влажность воздуха, колебания температуры, качество сырья).

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Патент РФ 2089615, МПК 6 С 12 Р 7/48, С 12 N 18/14, 1997.

2. Т. А. Никифорова, Е.Я. Щербакова. Селекция и биологические свойства митотического диплоида Asp. niger/ Ж. Хранение и переработка сельхозсырья, 1997, 12, с.51-53.

Штамм может быть использован в качестве продуцента лимонной кислоты при ферментации глубинным способом углеводсодержащих сред. Диплоидный штамм Aspergillus niger ВКПМ F-817 получен селекцией методом полиплодии. При ферментации новым штаммом выход лимонной кислоты от сахара составляет: на разбавленной мелассной среде с концентрацией сахара 30 г/дм³ - 87,0%, на концентрированной мелассной среде с концентрацией сахара 130 г/дм³ - 66%, на сахарозо-минеральной среде с концентрацией сахара 150 г/дм³ - 95,6%. Технический результат изобретения заключается в получении нового диплоидного штамма Aspergillus niger, имеющего устойчивость к морфологической изменчивости при хранении и стабильно высокую продуктивность. 2 табл.

Диплоидный штамм Aspergillus niger ВКПМ F-817 - продуцент лимонной кислоты.