СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АЗОТОФИКСИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ Российский патент 2004 года по МПК C05F11/08 

Изобретение относится к области сельского хозяйства, растениеводства и касается вопросов производства, применения и хранения бактериальных удобрений, и может быть использовано при возделывании бобовых трав и других сельскохозяйственных растений.

Нерешенными проблемами производства и практического применения бактериальных препаратов в полевых условиях являются относительно низкая скорость размножения клубеньковых бактерий и их невысокая жизнестойкость при хранении и использовании. Содержащиеся в основном известном носителе - торфе вещества фенольной природы оказывают неблагоприятное воздействие на клубеньковые бактерии, в результате чего процесс азотофиксации оказывается ослабленным.

Известны способы стимуляции азотофиксации путем выведения новых технологически выгодных штаммов бактерий с повышенной экологической валентностью, используемых при производстве бактериальных удобрений [Патент РФ №2061666, 6 С 05 F 11/08, 1996. Наумывакин Л.В., Пирузян Э.С., Соловьев В.П., Чернин Л.С., Тильба В.А. Штамм бактерий Rhizobium fredii для приготовления бактериального удобрения; Патент РФ №2074159, 6 С 05 F 11/08, 1997. Ожиганова Г.У., Ланских Г.П., Чернов И.А. Штамм бактерий Azotobacter chroococcum, используемый для получения бактериального удобрения под зеленые культуры].

Известно применение торфо-навозного компоста в качестве органического носителя, причем полученную смесь, инокулированную бактериальной составляющей, инкубируют при перемешивании в течение 3-5 суток [Патент РФ №2084431, 6 С 05 F 11/08, 1997. Юдкин Л.Ю., Ковалев Н.Г., Хотянович А.В., Темнова О.В. Способ получения бактериального удобрения]. Недостатками указанных способов являются соответственно узость применения и, в последнем случае, высокая трудоемкость и затраты энергии.

Существует способ внесения раствора бактериального препарата в пределах 0,5-5,0· 10¹² бак/га внекорневым способом на вегетирующие растения [Патент РФ №2193837, А 01 С 21/00, С 05 F 11/08, 2001. Киров Е.И., Майстренко Г.Г., Макаров В.И., Куценогий К.П. Способ внесения в почву азотфиксирующих бактерий]. Однако этот способ предусматривает дополнительные, отдаленные от момента посева мероприятия, связанные с дополнительными затратами материалов и энергии, а также является зависимым от метеоусловий.

Известен способ стимулирования азотофиксирующих бактерий бобовых трав [Патент РФ №2111636, А 01 В 79/02, А 01 С 21/00, 1998. Бекузарова С.А., Абаев А.А., Фарниев А.Т. Способ стимулирования азотофиксирующих бактерий бобовых трав]. В качестве стимулятора в этом случае используют экстракт - отход крахмало - паточного производства, который в количестве 90-100 кг/га в виде водного раствора вносят в виде подкормки через 13-15 дней после появления всходов. Недостатком способа является его относительная дороговизна и малодоступность экстракта, а также тот факт, что даже незначительное превышение указанной дозы существенно подкисляет смесь и отрицательно сказывается на микрофлоре почвы.

Существует способ стимулирования азотофиксирующих бактерий бобовых культур путем интенсивного применения макро- и микроэлементов [Посыпанов Г.С. Влияние интенсивного возделывания бобовых трав на их симбиотическую активность, сбор белка и повышение плодородия почвы - Вестник с.х. науки, №9, 1987. С.62-64]. После внесения биоудобрения в почву производят внесение минеральных удобрений для стимулирования жизнедеятельности азотофиксаторов. В указанном способе неизбежны значительные затраты материальных средств на внесение минеральных удобрений под травы, что на современном этапе может позволить себе лишь небольшое число хозяйств. Другим слабым местом способа является риск передозировки и снижения качества продукции.

Наиболее близким по технологической сущности является метод культивирования азотофиксирующих бактерий, предусматривающий выращивание маточной культуры бактерий на среде следующего состава: горох (отвар) - 100,0 мл; глюкоза - 10,0 г; (NH₄)₂SO₄ - 1,0 г; КН₂РO₄·_{Н2О - 0,5 г; К2НРO4 - 0,5 г; MgSO4·7Н2О - 0,3 г; Са СО3 - 1,0 г., затем изготовление рабочей культуры на среде, содержащей (г/л): глюкоза - 20,0; кукурузный экстракт - 10,0; дрожжевой экстракт - 0,25; КН2РO4·Н2О - 0,5; К2НРO4 - 0,5; MgSO4·7H2O - 0,3; Са СО3 - 1,0, после чего осуществление инокуляции подготовленного торфа - массированное внесение жидкой культуры в торф [Хотянович А.В. Методы культивирования азотфиксирующих бактерий, способы получения и применения препаратов на их основе (Методические рекомендации) Ленинград, 1991]. Недостатками данного метода являются риск угнетения культуры при использовании солей K, Mg, Са, нарушениях в системе аэрации, даже при незначительном изменении реакции среды, а также узкий диапазон температур хранения культур.}

Предлагаемый способ обеспечивает повышение титра бактерий в культуральной жидкости, жизнеспособности и активности бактериальной составляющей удобрений, расширение ассортимента стимуляторов при снижении материальных затрат. Это достигается тем, что в способе культивирования азотфиксирующих бактерий, включающем выращивание маточной культуры, затем изготовление рабочей культуры, после чего осуществление инокуляции подготовленного торфа - массированное внесение жидкой культуры в торф, согласно изобретению в питательную среду для маточной или для рабочей культуры вносят водный раствор селената натрия с тем, чтобы конечная концентрация селената натрия составила 1-10^-4 г/л жидкой питательной среды.

Содержащийся в веществе микроэлемент селен способен увеличивать активность практически всех звеньев антиоксидантной системы микроорганизмов, лимитирующей их рост и развитие без негативного воздействия на ферментативный аппарат. Это позволяет не только повысить жизнеспособность и активность азотофиксаторов, но и значительно сократить сроки и увеличить диапазон температур культивирования азотфиксирующих бактерий.

Другим признаком, выгодно отличающим предлагаемый способ от известных, является то, что использование сверхнизких доз селеновой соли не требует значительных экономических затрат, так как используемое количество вносимого вещества (селенат натрия) очень мало.

Пример 1.

Для решения задачи в жидкую питательную среду, следующего состава:

Горох (отвар) 100,0 мл

Глюкоза 10,0 г

(NH₄)₂SO₄ 1,0 г

КН₂РO₄·_{Н2O 0,5 г}

К₂НРO₄ 0,5 г

MgSO₄·_{7H2O 0,3 г}

СаСО₃ 1,0 г

объемом 200 мл, разлитую в колбы емкостью 750 мл и предназначенную для культивирования бактерий, вносят раствор селената натрия (Na₂SeO₄), с тем расчетом, чтобы его конечная концентрация в питательной среде составляла 1· 10^-4 г/л. Питательная среда подвергается стерилизации при обычном режиме. После автоклавирования смывы с пробирок со штаммом определенных видов бактерий помещаются в жидкую питательную среду. Колбы помещаются в качалку на двое суток до достижения в них определенного титра бактериальных клеток (титр индивидуален для разных штаммов). Температура питательной среды 25-28° С. Культуральная жидкость из колб помещается в рабочие бутыли емкостью 5-10 л, которые помещаются на двое суток на качалку. Тем самым получается концентрированная суспензия бактериальных клеток, которая затем используется для приготовления готовых препаратов.

Пример 2.

Жидкую питательную среду, следующего состава:

Глюкоза 20,0

Кукурузный экстракт 10,0

Дрожжевой экстракт 0,25

КН₂РO₄·_{Н2O 0,5}

К₂НРO₄ 0,5

СаСО₃ 1,0

разлитую в бутыли емкостью 5-10 л и предназначенную для культивирования бактерий, стерилизуют, инокулируют маточными культурами определенных видов бактерий и добавляют стерильный раствор селената натрия, с тем, чтобы конечная концентрация составила 1· 10^-4 г/л вещества. Колбы помещаются в качалку на двое суток до накопления в них определенного титра бактериальных клеток. Температура в качалке 25-28° С. Тем самым получается концентрированная суспензия бактериальных клеток, которая затем используется для приготовления готовых препаратов.

Во всех случаях титр бактерий в препарате значительно превышает контрольные показатели. Так при обогащении селеном жидкой питательной среды в колбах (пример 1) конечный титр превысил контрольный на 32% (ризоторфин) и 33,5% (агрофил).

При внесении селената натрия в бутыли для создания рабочей культуры в условиях качалки (пример 2) конечный титр бактерий превысил контрольные показатели на 31,7% и 34% для ризоторфина и агрофила соответственно.

Результаты исследований внесения селената натрия различными способами приведены в таблице.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, растениеводства, касается вопросов производства, применения и хранения бактериальных удобрений и может быть использовано при возделывании бобовых трав и других сельскохозяйственных растений. Способ включает выращивание маточной культуры бактерий на питательной среде и изготовление рабочей культуры на соответствующей питательной среде. В питательную среду для выращивания маточной культуры или в питательную среду для культивирования рабочей культуры вносят водный раствор селената натрия с тем, чтобы конечная концентрация селената натрия составила 1·10^-4 г/л жидкой питательной среды. Способ обеспечивает повышение жизнеспособности и активности бактериальной составляющей удобрений, расширение ассортимента стимуляторов при снижении материальных затрат. 1 табл.

Способ культивирования азотофиксирующих бактерий, включающий выращивание маточной культуры бактерий на питательной среде и изготовление рабочей культуры на соответствующей питательной среде, отличающийся тем, что в питательную среду для выращивания маточной культуры или в питательную среду для культивирования рабочей культуры вносят водный раствор селената натрия с тем, чтобы конечная концентрация селената натрия составила 1·10^-4 г/л жидкой питательной среды.