СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЕНОМНОЙ ДНК ИЗ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2002 года по МПК C12P19/34 C12N15/10 C12Q1/68 

Изобретение относится к молекулярной биологии, а именно к методам выделения ДНК, и может быть использовано в лабораторной и исследовательской практике для выделения высокомолекулярных ДНК или их фрагментов (макрорестриктов) из клеток дрожжей и грамположительных микроорганизмов, пригодных для их последующего анализа с помощью техники пульс-электрофореза, а также при постановке ПЦР и для клонирования.

Клеточные стенки дрожжей, а также многих грамположительных микроорганизмов устойчивы к действию большинства лизирующих агентов, в том числе детергентов, щелочей и солей-хаотропов.

Известен способ выделения геномной ДНК из дрожжей и грамположительных микробов, основанный на разрушении их клеточных стенок литическими ферментами, например, зимолиазой или лизоцимом, с последующей обработкой образующихся протопластов (сферопластов) детергентами и протеиназой К [1]. В некоторых случаях для выделения ДНК применяют комбинированные подходы (например, клетки дрожжей обрабатывают литическими ферментами в сочетании с замораживанием и оттаиванием [2] или осуществляют механическую деструкцию грибного мицелия и дрожжей с помощью высокоскоростных дезинтеграторов в присутствии хаотропных агентов [3]). Для разрушения клеток дрожжей при выделении ДНК часто используют мелкие стеклянные шарики [4]. Описаны также методы выделения ДНК из клеток грам-положительных микроорганизмов и дрожжей с помощью обработки последних 3% SDS [5, 6]. Следует отметить, что, используя вышеперечисленные методы, не удается получить интактную (т.е. не содержащую двухцепочечных разрывов) геномную ДНК - в процессе выделения хромосомные ДНК в растворе подвергаются гидродинамическим разрывам, т.е. фрагментируют.

Известен наиболее близкий к заявленному способ выделения интактной геномной ДНК для определения размера хромосом с помощью техники пульс-электрофореза, где лизис соответствующих клеток или протопластов проводят в блоках из легкоплавкой агарозы, что предотвращает гидродинамические разрывы ДНК [7] . После обработки клеток литическими ферментами гелевые блоки инкубируют в буфере, содержащем детергент и протеиназу К, и таким образом осуществляют депротеинизацию ДНК. Детергенты, протеиназу К, пептиды и другие компоненты клеток удаляют затем путем многократной промывки гелевых блоков в соответствующем промывочном буфере. После промывки и смены буфера интактные хромосомные ДНК, иммобилизованные в агарозе, фракционируют в агарозном геле с помощью пульс-электрофореза [7].

Вышеописанный способ имеет ряд недостатков, которые затрудняют его использование в качестве способа выделения интактной хромосомной ДНК.

Недостатки способа:
1) длительность и значительная трудоемкость выполнения операций;
2) дороговизна;
3) невысокая воспроизводимость.

Вследствие того, что в геле агарозы диффузия ферментов, структурных белков, полисахаридов и даже низкомолекулярных компонентов сильно замедлена, процедура приготовления агарозных блоков с интактными ДНК занимает несколько суток. Последующая обработка гелевых блоков специфическими рестриктазами с целью получения макрорестриктов ДНК и их последующего пульс-электрофореза еще более усложняют и удорожают этот способ. Так, для получения макрорестриктов ДНК гелевые блоки после обработки протеиназой К интенсивно промывают в соответствующем отмывочном буфере, а затем инкубируют в буфере с PMSF (фенилметилсульфонилфторидом) - ингибитором протеиназы К (для полного удаления следов протеолитической активности). После этого блоки промывают в буфере для конкретной рестриктазы и лишь после этого добавляют рестриктазу. Причем обработка рестриктазами, как правило, проводится в течение нескольких часов или в течение ночи. Следует подчеркнуть, что для полного расщепления ДНК в гелевых блоках требуются значительно большие количества рестриктаз по сравнению с расщеплением ДНК в растворе. На конечной стадии агарозные блоки промывают в буфере 0,5Х ТВЕ или в промывочном буфере с 50 mM ЭДТА, рН 8.0, после чего макрорестрикты ДНК подвергают пульс-электрофорезу.

Изобретение решает задачу упрощения процедуры, снижения трудоемкости и удешевления способа.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе выделения ДНК из клеток микроорганизмов гидролизом компонентов клеточных стенок с помощью литических ферментов предварительно клетки микроорганизмов обрабатывают буферным раствором с нейтральным значением рН, содержащим соль-хаотроп.

Способ осуществляют следующим образом.

Клетки микроорганизмов выращивают в жидких или на агаризованных питательных средах различного состава любым известным способом. Преимущественно используют богатые питательные среды. Биомассу клеток (конец логарифмической фазы роста) собирают центрифугированием и отмывают от питательной среды холодным буфером с рН, близким к нейтральному и содержащим ЭДТА (от 10 до 50 mM). Клетки суспендируют в буфере для экстракции со значением рН, близким к 8.0, содержащим соль-хаотроп (6-8 М гуанидинхлорид или 4М гуанидинтиоцианат), детергент (0,5% саркозил) и восстановитель дисульфидных связей (10-100 mM меркаптоэтанол). При этом соотношение объема экстракционного буфера к объему клеточного осадка должно превышать 5:1 для дрожжей и 20:1 - для бактерий. Оптимальным для дрожжей является соотношение (5-10):1; для грамположительных микроорганизмов - (20-30):1.

Для получения интактной геномной ДНК, пригодной для определения размера хромосом с помощью техники пульс-электрофореза, клетки инкубируют в экстракционном буфере при температуре на 5-10^oС ниже температуры плавления ДНК (в данном буфере) в течение нескольких часов (например, 2-3 ч при 45^oС), содержащем высокие концентрации солей-хаотропов. Клетки затем осаждают центрифугированием и суспендируют в том же объеме свежего экстракционного буфера. Клетки инкубируют в свежем буфере при той же температуре в течение нескольких часов (4-5 ч, 45^oС), либо оставляют на ночь при 37^oС.

После второй экстракции клетки осаждают центрифугированием и дважды промывают стерильной дистиллированной (деионизованной) водой и получают пермеабилизованные (т. е. проницаемые для белков) клеточные оболочки, содержащие высокоочищенные (депротеинизированные) интактные хромосомные ДНК и некоторую часть РНК. Полученные вышеуказанным образом образцы ДНК могут быть использованы для определения размера хромосом методом пульсэлектрофореза, для получения макрорестриктов ДНК, а также для клонирования и ПЦР-амплификации.

Для доказательства высокого качества образцов ДНК в составе клеточных оболочек проводят иммобилизацию последних в геле агарозы по стандартной схеме [7] , т.е. получают гелевые блочки. Клеточные оболочки в составе гелевых блочков разрушают затем с помощью литических ферментов (зимолиазы, лизоцима и т. д. ) и детергентов (саркозила, SDS). Полученные в результате такой обработки агарозные блочки с иммобилизованной ДНК промывают в соответствующем отмывочном буфере (содержащим ЭДТА), а ДНК в составе блочков подвергают затем пульс-электрофорезу. Дополнительным критерием высокого качества получаемых образцов ДНК является возможность получения на их основе макрорестриктов ДНК. Для получения и анализа макрорестриктов ДНК клеточные оболочки с ДНК и РНК суспендируют в соответствующем буфере для РНКазы и обрабатывают РНКазой (не содержащей примеси ДНКаз) до полного расщепления РНК. Образующиеся при этом клеточные облочки с ДНК отмывают от РНКазы и фрагментов РНК, переводят в буфер для конкретной рестриктазы и затем инкубируют с соответствующей рестриктазой. После этого клеточные оболочки с макрорестриктами ДНК иммобилизуют в агарозном геле и проводят все остальные операции, описанные выше, включая пульс-электрофорез ДНК.

Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что предложенный способ существенным образом отличается от известного [7].

Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критерию изобретения "новизна".

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Пример 1. Получение интактной геномной ДНК и ее макрорестриктов из Saccharomyces cerevisiae.

Биомассу S. cerevisiae YPH499 (дикий штамм) выращивают в колбе с 200 мл среды YPD (1,0% дрожжевого экстракта, 2,0% бактопептона, 2,0% глюкозы, рН 5,3) при 30^oС в условиях аэрации (70 об/мин) в течение ночи. Культивирование прекращают при достижении титра 1-2•10⁹. Клетки осаждают центрифугированием (10 мин при 3000 об/мин, центрифуга Heraeus, ФРГ). Полученные осадки суспендируют в 15 мл холодного (+4^oС) 50 mM ЭДТА, рН 8.0.

Суспензию клеток переносят в 1.5 мл центрифужные пробирки Eppendorf и центрифугируют в течение 1 мин при 12 тыс. об/мин. Супернатант выбрасывают.

В пробирки, содержащие 0,4 мл клеточного осадка, вносят 1 мл буфера для экстракции - буфер I (4M гуанидинтиоцианат, 50 мМ трис-HCl, рН 8.0, 5 мМ ЭДТА, 0,1М меркаптоэтанола, 0,5% лауроилсаркозина). Осадки тщательно суспендируют с помощью наконечника для автоматической микропипетки. Пробирки с суспензией клеток инкубируют 2-3 ч при 45^oС без встряхивания.

Клетки осаждают центрифугированием (1 мин, 12 тыс. об/мин). Супернатант выбрасывают. Осадки суспендируют в 1 мл свежего буфера I и инкубируют далее в течение ночи при 37^oС, либо 3-4 ч при 45^oС. Суспензию клеток центрифугируют 30-60 с при 12 тыс. об/мин. Супернатант выбрасывают. Осадки (на этой стадии их объем составлял 200 мкл, т.е. сокращается в 2 раза) промывают дважды деионизованной водой mQ (по 1 мл), а затем суспендируют в 50 mM ЭДТА, рН 8.0. Объем суспензии доводят до 400 мкл. Полученные на этой стадии клеточные оболочки с ДНК и РНК можно хранить длительное время при +4^oС.

Для удаления из клеток РНК и получения макрорестриктов ДНК промытые водой клеточные оболочки, полученные выше, суспендируют в 500 мкл буфера, содержащего 50 mM трис-HCl, рН 8.0 и 10 mM ЭДТА. К полученной суспензии добавляют 2-3 мкл раствора РНКазы А (из ICN Biomedicals Inc.) поджелудочной железы теленка (10 мг/мл), предварительно прогретой в течение 15 мин при 100^oС для инактивации ДНКаз, и инкубируют при комнатной температуре в течение 30-40 мин или при 37^oС в течение 15 мин.

Клеточные оболочки с ДНК осаждают центрифугированием, промывают однократно 1 мл H₂O и суспендируют в 200 мкл двухкратного буфера для рестриктазы NotI (Fermentas, Литва). К суспензии добавляют рестриктазу NotI (10 ед.) и смесь инкубируют 5 ч при 37^oС.

Клеточную суспензию центрифугируют (1 мин при 12 тыс. об/мин). Супернатант выбрасывают, а осадки суспендируют в 50 mM ЭДТА, рН 8.0. Объем суспензии доводят при этом до 400 мкл.

Анализ ДНК в составе клеточных оболочек проводят следующим образом. К суспензии клеточных оболочек, содержащих интактные ДНК или их макрорестрикты в 50 mM ЭДТА, рН 8.0, добавляют по 10 мкл раствора зимолиазы (концентрацию зимолиазы подбирают экспериментально), нагревают до 40^oС и смешивают с предварительно расплавленной а затем остуженной до 40^oС 1-1,5% легкоплавкой агарозой (Sea plaque, фирмы FMS (США). Полученной смесью заливают формочки (V= 200 мкл) и при охлаждении последних (4^oС, 20 мин) получают гелевые блочки. Гелевые блочки переносят в 50 мл центрифужные пластиковые пробирки (Costar, Англия), содержащие равный объем 50 mM ЭДТА, рН 8.0 и 7,5% меркаптоэтанола и инкубируют при 37^oС в течение 6 ч. (На этой стадии происходит гидролиз клеточных оболочек дрожжей).

Гелевые блочки промывают далее 3 раза 50 mM ЭДТА, рН 8.0, переносят в буфер ES (50 mM ЭДТА, рН 8.0; 0,5% лауроилсаркозина (ICN Biomedicals Inc.) и инкубируют 2-3 ч при 50^oС. Объем буфера ES - в 4-5 раз больше объема гелевых блочков. В присутствии буфера ES происходит разрушение клеточных оболочек и ДНК выходит в гель.

Гелевые блочки отмывают несколько раз 50 mM ЭДТА, рН 8.0 и сохраняют в этом буфере при +4^oС.

Гелевые блочки разрезают на фрагменты, переносят в лунки 1%-ного агарозного геля (Sigma, США) и ДНК подвергают пульс-электрофорезу.

Как следует из результатов проведенных экспериментов, в ходе пульс-электрофореза полученных нами нативных образцов ДНК S. cerevisiae образуется свыше 10 дискретных полос, соответствующих по своей подвижности (а следовательно и по размеру) отдельным дрожжевым хромосомам. Это следует из того, что аналогичное распределение полос наблюдается и в контрольном образце-стандарте - продукте фирмы Bio-Rad (США), содержащем набор хромосомных ДНК S. cerevisiae. При обработке хромосомных ДНК S. cerevisiae рестриктазой NotI количество дискретных полос на электрофореграммах значительно возрастает, а их подвижность увеличивается. Это свидетельствует о том, что наблюдаемые полосы действительно соответствуют макрорестриктам дрожжевых хромосом.

Пример 2. Получение интактной геномной ДНК и ее макрорестриктов из клеток Listeria monocytogenes.

Клетки L. monocytogenes L O28 выращивают в мясо-пептонном бульоне (производства НИИ Микробиологии и Эпидемиологии им. Н.Ф. Гамалеи, Москва) при 37^oС в течение ночи. В этих условиях титр клеток составляет 1•10⁹.

Клетки из 50 мл культуральной жидкости осаждают центрифугированием (10 мин при 3000 об/мин, центрифуга Heraeus, ФРГ). Полученные осадки суспендируют в 1/10 первоначального объема холодного (0^oС) буфера (50 mМ трис НСl, рН 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM ЭДТА). По 1 мл суспензии клеток в буфере вышеприведенного состава переносят в 1,5 мл центрифужные пробирки Eppendorf и центрифугируют в течение 1 мин при 12 тыс. об/мин.

Супернатант выбрасывают. Клеточные осадки суспендируют в 0,5 мл экстракционного буфера II (4М гуанидинтиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0,1М меркаптоэтанола, 0,5% лауроилсаркозила). Суспензию инкубируют 2 ч при 45^oС без встряхивания.

Клетки осаждают центрифугированием (1 мин при 12 тыс. об/мин). Супернатант выбрасывают. Осадки суспендируют в 0,5 мл свежего экстракционного буфера II и продолжают инкубацию в течение ночи при 37^oС.

Суспензию клеток центрифугируют (1 мин при 12 тыс. об/мин). Супернатант выбрасывают. Осадки промывают дважды деионизованной водой (mQ) по 1 мл, а затем суспендируют в 50 mM ЭДТА, рН 8,0. В таком виде клеточные оболочки с ДНК и РНК можно длительно хранить при +4^oС.

Качество ДНК в полученных образцах проверяют с помощью пульс-электрофореза. При этом образцы для пульс-электрофореза готовят стандартным методом (см. пример 1).

Для удаления РНК и получения макрорестриктов ДНК промытые водой клеточные оболочки, содержащие ДНК и РНК, суспендируют в 200 мкл буфера 50 mМ трис-HCl, рН8.0 и 10 mM ЭДТА. К полученной суспензии добавляют 2-3 мкл раствора РНКазы А (10 мг/мл) и инкубируют при комнатной температуре в течение 30-40 мин или при 37^oС в течение 15 мин.

Клеточные оболочки с ДНК осаждают центрифугированием, промывают 1 мл деионизованной воды и суспендируют в 200 мкл буфера для рестриктазы NotI.

К суспензии добавляют рестриктазу Notl (10 ед.) и смесь инкубируют 5 ч при 37^oС.

Клеточные оболочки с макрорестриктами ДНК осаждают центрифугированием (1 мин при 12 тыс. об/мин) и суспендируют в 200 мкл буфера 50 mM трис-HCl, рН 8.0 и 10 mM ЭДТА, содержащего лизоцим (2 мг/мл). Смесь нагревают до 40^oС и смешивают с предварительно расплавленной, а затем остуженной до 40^oС 1-1,5% легкоплавкой агарозой. Полученной смесью заливают формочки (V=200 мкл) и при охлаждении последних (4^oС, 20 мин) получают гелевые блочки.

Гелевые блочки с иммобилизованными клеточными оболочками переносят в буфер 50 mM трис-HCl, рН 8.0 и 10 mM ЭДТА (объем буфера превышает объем гелевых блочков в 3 раза) и инкубируют при 37^oС в течение 2-3 ч.

Гелевые блочки промывают несколько раз 50 mM ЭДТА, рН 8.0 и переносят затем в лизирующий буфер (50 mM ЭДТА, рН 8.0, 1% SDS) и инкубируют в этом буфере 1-2 ч при 50^oС. Гелевые блочки промывают несколько раз 50 mM ЭДТА, рН 8.0 и оставляют их в этом буфере для хранения при +4^oС.

Гелевые блочки разрезают на фрагменты, переносят в лунки 1%-ного агарозного геля (Sigma, США) и ДНК подвергают пульс-электрофорезу.

В ходе пульс-электрофореза полученных нами нативных образцов ДНК L. monocylogenes была выявлена единственная дискретная полоса, соответствующая по своей подвижности нативной хромосной ДНК данного микроорганизма (размер хромосомы L. monocytogenes - около 3000 kb). При фракционировании образцов хромосомных ДНК, обработанных рестриктазой NotI, мы наблюдали восемь дискретных полос, соответствующих макрорестриктам (Notl-рестриктам) ДНК L. monocytogenes. Размер последних варьировал от 1100 до 20 kb. Полученные результаты хорошо соответствуют литературным данным [8].

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Mann W., J. Jeffery, Anal. Biochem. 1989. 178(1):82-87.

2. Philippsen P. , A. Stolz., C. Scherf. Methods in Enzymology. 1991. 194: 169-182.

3. Muller F.M., K.E. Werner, M. Kasai, A. Francesconi, S.J. Chanock, T. J. Walsh. J. Clin. Microbiol. 1998. 36(6):1625-1629.

4. Hoffman C.S., F. Winston. Gene. 1987. 57(2-3):267-272.

5. Bollet C. , M. J. Gevaudan, X. de Lamballerie, C. Zandotti, P. de Micco. Nucl. Acid. Res. 1991. 19: 955.

6. Polaina J., A.C. Adam. 1991. Nucleic Acid Res. 1991. 19(19):5443.

7. Schwartz D.C., C.R. Cantor. Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis. Cell. 1984. V. 37. P. 67-75.

8. Michel E., P. Cossart. J. Bacteriol. 1992. 174(22). 7098-7103.

Изобретение относится к молекулярной биологии, а именно к методам выделения ДНК, и может быть использовано в лабораторной и исследовательской практике для выделения высокомолекулярных ДНК или их фрагментов (макрорестриктов) из клеток дрожжей и грамположительных микроорганизмов, пригодных для их последующего анализа с помощью техники пульс-электрофореза, а также при постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР) и для клонирования. Дрожжи или грамположительные бактерии обрабатывают буферным раствором с нейтральным значением рН, содержащим соль - хаотроп. Соль выбирают из группы производных гуанидиния в концентрации 4-8 М. Клетки инкубируют в экстракционном буфере при температуре на 5-10^oС ниже температуры плавления ДНК в данном буфере. Затем выделяют геномную ДНК, прочно ассоциированную с клеточными оболочками микроорганизмов. Проводят гидролиз компонентов клеточных стенок микроорганизмов литическими ферментами. Изобретение позволяет упростить процедуру, снизить трудоемкость и удешевить способ выделения интактных геномных ДНК из клеток дрожжей и других микроорганизмов с прочной клеточной стенкой за счет того, что депротеинизация и очистка ДНК от белков, липидов и полисахаридов, а также низкомолекулярных компонентов проводится без предварительного разрушения клеточных оболочек. 1 з.п.ф-лы.

1. Способ выделения геномной ДНК из клеток микроорганизмов, предусматривающий гидролиз компонентов клеточных стенок микроорганизмов литическими ферментами, отличающийся тем, что из микроорганизмов используют дрожжи или грамположительные бактерии, перед гидролизом проводят обработку клеток буферным раствором с нейтральным значением рН, содержащим соль - хаотроп, выбранную из группы производных гуанидиния, в концентрации 4-8 М при температуре на 5-10^oС ниже температуры плавления ДНК в данном буфере, с последующим выделением геномной ДНК, прочно ассоциированной с клеточными оболочками микроорганизмов. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что объемное соотношение буферного раствора и клеток микроорганизмов превышает 5: 1.