СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ТИМИДИН-ФОСФОРИЛАЗЫ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PERTPHO1 И ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/PERTPHO1-ПРОДУЦЕНТ ТИМИДИН-ФОРФОРИЛАЗЫ Российский патент 2002 года по МПК C12N9/10 C12N1/21 C12N15/70 C12N1/21 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии. Оно включает сконструированную in vitro рекомбинантную плазмидную ДНК pERTPHO1, обусловливающую биосинтез тимидин-фосфорилазы Е. coli, штамм Е. coli BL21(DE3)/pERTPHO1 - суперпродуцент тимидин-фосфорилазы и способ получения тимидин-фосфорилазы на основе вышеуказанной рекомбинантной ДНК и штамма-продуцента.

Тимидин-фосфорилаза Escherichia coli (КФ 2.4.2.4) катализирует катаболическую реакцию фосфоролиза пиримидиновых нуклеозидов в клетках Е. coli [1,2]. Она представляет собой белок с мол.массой 47,3 кДа, функционирующий в виде димера с мол. массой 94,6 кДа [1]. Ферментативная активность тимидин-фосфорилазы позволяет использовать ее в реакции трансгликозилирования при синтезе модифицированных нуклеозидов, которые находят применение в медицине в качестве терапевтических препаратов [3,4], или в качестве компонента смешанных противоопухолевых препаратов [5].

Для практических целей до последнего времени использовали главным образом ферментативную активность целых бактериальных клеток Е. coli [6], а также изолированную из Е. coli тимидин-фосфорилазу [7,8], или фермент в иммобилизованной форме [9].

Известно клонирование гена тимидин-фосфорилазы Е. coli (deoA) в плазмиде рКК-226 [7] со сравнительно невысокой эффективностью биосинтеза (до 0,4 г/л культуры).

Известен наиболее близкий к заявленному продуцент тимидин-фосфорилазы Е. coli с плазмидой pUTPP, позволяющий получать при индуцированном ИПТГ биосинтезе высокий выход фермента (содержание в клетках до 51% тотального белка), и способ его выделения [8]. Настоящее изобретение решает задачу получения высокопродуктивного рекомбинантного бактериального штамма-продуцента фермента, позволяющего получать рекомбинантную тимидин-фосфорилазу с высоким выходом и по упрощенной технологии.

Поставленная задача решается за счет того, что штамм-продуцент, полученный трансформацией клеток Escherichia coli плазмидной ДНК, культивируют до накопления рекомбинантной тимидин-фосфорилазы в количестве 60-70% от суммарного белка клеток, разрушают клетки в буферном растворе и отделяют растворимую фракцию. Содержание в этой фракции тимидин-фосфорилазы составляет до 80% суммарного содержания белка, который может быть использован без дополнительной очистки, либо очищен до гомогенного состояния гель-хроматографией, либо его ферментативная активность может быть повышена в условиях рефолдинга.

Используют штамм-продуцент Escherichia coli BL21(DE3), содержащий плазмидную ДНК pERTPHO1 - суперпродуцент тимидин-фосфорилазы.

Используют рекомбинантную плазмидную ДНК pERTPHO1
- кодирующую аминокислотную последовательность тимидин-фосфорилазы Е. coli;
- имеющую молекулярную массу 2,98 МДа;
- состоящую из:
NdeI/SalI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ20b(+), содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, ген β-лактамазы, и NdeI/SаlI-фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность гена тимидин-фосфорилазы Escherichia coli;
- содержащую:
в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующей устойчивость трансформированных плазмидой pERTPHO1 клеток E.coli к пенициллиновым антибиотикам; уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта NdeI: XbaI - 38 п.о., BglII - 96 п.о., PvuII - 741 п.о., PstI - 2288 п.о, PvuI - 2413 п.о., SalI - 4918 п.о.

Используют штамм-продуцент Escherichia сoli BL21(DE3), содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pERTPHO1 - продуцент тимидин-фосфорилазы.

Предлагаемое изобретение позволяет получать рекомбинантную тимидин-фосфорилазу по простой технологии и с высоким выходом.

Конструкция рекомбинантной плазмидной ДНК pERTPHO1 обеспечивает высокий уровень экспрессии клонированного в ней гена тимидин-фосфорилазы.

Для конструирования плазмиды использован химический подход, позволяющий использовать для экспрессии клонированного структурного гена оптимальные регуляторные элементы, контролирующие его экспрессию.

Источником структурного гена тимидин-фосфорилазы служит хромосомная ДНК Е. сoli. Рекомбинантный ген выделяют с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами и затем клонируют в векторную плазмиду рЕТ-20b.

Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli BL21(DE3)/pERTPHO1 характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре "Дифко" - колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или YT-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.

Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4^oС до 40^oС при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).

Штамм-продуцент Е. сoli BL21(DE3)/pERTPHO1 отличается от штамма-реципиента Е. сoli BL21(DE3) только наличием рекомбинантной плазмидной ДНК pERTPHO1, которая и придает ему устойчивость к пенициллиновым антибиотикам.

Штаммы-продуценты получают путем трансформации компетентных клеток E. coli BL21(DE3) соответствующей рекомбинантной плазмидной ДНК.

Клетки Е. сoli BL21(DE3)/pERTPHO1 являются суперпродуцентом тимидин-фосфорилазы. При индукции изопропилтио-β-D-галактозидом, а также и без индукции происходит эффективный биосинтез тимидин-фосфорилазы, которая накапливается в клетках в количестве более 60% суммарного белка бактерий.

Штамм-продуцент депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, ВКПМ В-7976 от 25 мая 2000 г.

Изобретение осуществляют следующим образом. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pERTPHO1, для чего ген тимидин-фосфорилазы выделяют из хромосомной ДНК Е. coli с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами (чертеж), содержащими сайты рестриктаз NdeI (N-конец гена, праймер А1) и SalI (С-конец гена, праймер В1), полученную ДНК расщепляют соответствующими рестриктазами и затем лигируют с расщепленной по тем же сайтам векторной плазмидой рЕТ-20b.

Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки Е. coli BL21(DE3) и высевают на YT-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина или другого пенициллинового антибиотика. Полученные клоны анализируют гибридизацией ³²Р-мечеными олигонуклеотидами А1 и В1 (чертеж), и из гибридизующихся клонов выделяют плазмидную ДНК, которую подвергают рестриктному анализу с помощью рестриктаз NdeI и SalI. Штамм-продуцент Е. coli BL21(DE3)/pERTPHO1 выращивают в богатой среде (YT-, LB-бульон и др.) (или индуцируют изопропилтио-β-D-галактозидом, и снова выращивают) до достижения максимальной плотности культуры.

Выделение тимидин-фосфорилазы из клеток продуцента включает следующие стадии:
- разрушение выращенных клеток при помощи ультразвука;
- отделение растворимой фракции центрифугированием; содержание в этой фракции тимидин-фосфорилазы составляет до 80% суммарного содержания белка, и фермент может быть использован без дополнительной очистки;
- из растворимой фракции целевой белок может быть очищен до гомогенного состояния стандартными методами.

На чертеже изображена структура гена тимидин-фосфорилазы и синтетических праймеров, использованных для выделения гена с помощью ПЦР и отбора клонов путем гибридизации.

Изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pERTPHO1
Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов - 5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтил- диизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 А), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл, описанный в работе [10].

Для приготовления вектора ДНК плазмиды рЕТ-20b (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфура R (10 мМ трис-HCl, рН 8,5, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ КСl, 0,1 мг/мл BSA) рестриктазой NdeI (10 ед.акт.), а затем - в 40 мкл буфера О (50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl 1 мМ DTT, 0,1 мг/мл BSA) рестриктазой SalI(10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37^oС. Векторный фрагмент величиной 3,6 т.п.о. после электрофореза в 1% агарозном геле электрофоретически перемещают в слой DEAE-бумаги, затем элюируют 1М NaCl и осаждают ДНК из раствора этанолом.

Для приготовления фрагмента гена тимидин-фосфорилазы проводят амплификацию с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы хромосомную ДНК Е. coli (0,01 мкг в образце), а в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды А1 и В1 (по 60 пмоль каждого). ПЦР проводят в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе, содержащем каждый из четырех dNTP в концентрации 0,5 мМ и 5 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы, в следующем режиме: денатурация - 1 мин при 94^oС, отжиг - 30 сек при 60^oС, элонгация - 40 сек при 72^oС, 30 циклов ПЦР. После этого реакционную смесь депротеинизируют хлороформом, упаривают досуха, остаток растворяют в 20 мкл воды, затем расщепляют теми же рестриктазами, которые использовались при приготовлении вектора, и выделяют целевой фрагмент из агарозного геля.

Полученный синтетический фрагмент с геном тимидин-фосфорилазы в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl₂, 0,2 мМ rАТР, 10 мМ дитиотреит) и лигируют с помощью 10 ед.акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10^oС.

Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е. coli BL21(DE3). Трансформанты высевают на чашки с YT-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью гибридизации колоний in situ с ³²Р-меченым олигонуклеотидом А1 (чертеж). Из гибридизующихся клонов выделяют ДНК плазмиды pERTPHO1 и анализируют с помощью эндонуклеаз NdeI и SalI.

Пример 2. Получение штамма Е. coli BL21(DE3)/ pERTPHO1 (ВКПМ В-7976) - продуцента тимидин-фосфорилазы и определение его продуктивности.

Клетки Е. сoli BL21(DE3), несущие плазмиду pERTPHO1, структура которой подтверждена данными анализа (см. пример 1), являются суперпродуцентом тимидин-фосфорилазы.

Штамм продуцента Е. coli BL21(DE3)/pERTPHO1 выращивают при 37^oС в 100 мл YT-бульона (рН 7,0) с 50 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч на качалке со скоростью вращения 190 об/мин до мутности А₅₅₀ 0,7-0,8, прибавляют изопропилтио-β-D-галактозид до концентрации 0,2 мМ и продолжают процесс еще 6 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, определяют А₅₅₀ и количество культуры, соответствующее 1 мл с А₅₅₀ 1,0,центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин. Осажденные клетки в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим обрабатывают 20 сек ультразвуком, нагревают 3 мин при 100^oС и пробы по 1 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют для определения относительного количества белка в полосе целевого белка.

Пример 3. Получение тимидин-фосфорилазы.

Влажные клетки (10 г) суспендируют в 20 мл буфера (30 мМ Na-фосфат, рН 7,0, 5% глицерин) и разрушают ультразвуком с помощью ультразвукового дезинтегратора Sonifier 240 (Branson) (3 импульса по 20 сек при А 2,0 и 0^oС). Гомогенат центрифугируют 10 мин при 10000 g и полученный супернатант с содержанием фермента до 80% от суммарного белка используют для реакции трансгликозилирования.

Источники информации
1. O'Donovan G.A., Neuhard Y.// Bacteriol.Revs., 1970, v.34, p.278.

2. Миронов А.С., Смирнов Ю.В., Суходолец В.В.// Генетика, 1975, т.11, с. 97.

3. Chae W.G., Cauchon N.S., Kozlowski J.F., Chang C.//J.Org.Chem., 1992, v.57, p. 1002-1005.

4. Schinazi R.F., Peck A., Sommadossi J.P.// Biochem.Pharmacol., 1992, v.44, p. 199-204.

5. WO Pat. 9308273, 29.04.93.

6. Khachatourians G. G., Brosseau J.D., Child J.J.// Biotechnol.Lett., 1982, v.4, p.735-740.

7. Barbac. III, C.F., Wong C.-H.//Bioorgan.Chem., 1991, v.l9, p.261-269.

8. Вейко В.П., Сипрашвили 3.3., Ратманова К.И., Гулько Л.Б., Андрюхина Р.В., Дебабов В.Г.//Биотехнология, 1994, т.4, с.2-4.

9. Гаевая Л.В., Жуков В.Н.// Прикл. Биохим. Микробиол., 1987, т.23, с. 309-316.

10. Atkinson Т., Smith M.// in: Oligonucleotide synthesis; a practical approach. 1984. Ed. Gait M.J. p.35-81. IRL Press, Oxford.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии. Рекомбинантная плазмидная ДНК pERTPHO1, кодирующая аминокислотную последовательность тимидин-фосфорилазы E. coli, состоит из NdeI/SalI-фрагмента ДНК плазмиды pET20b(+), содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, ген β-лактамазы, и NdeI/SalI-фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность гена тимидин-фосфорилазы Escherichia coli. Штамм-продуцент E. coli BL21(DE3)/pERTPHO1 получают путем трансформации компетентных клеток E. coli BL21(DE3) плазмидой pERTPHO1. Штамм-продуцент E. coli BL21(DE3)/pERTPHO1 выращивают в богатой среде (YT-, LB-бульон и др.) (или индуцируют изопропилтио-β-D-галактозидом, и снова выращивают) до достижения максимальной плотности культуры. Тимидин-фосфорилазу из клеток продуцента выделяют после разрушения выращенных клеток одним из обычно применяемых способов. Изобретение позволяет получать рекомбинантную тимидин-фосфорилазу с высоким выходом и по упрощенной технологии. 3 с.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ получения рекомбинантной тимидин-фосфорилазы, включающий культивирование штамма-продуцента, полученного трансформацией клеток Escherichia coli плазмидной ДНК с последующим разрушением клеток в буферном растворе, отличающийся тем, что в качестве плазмидной ДНК используют рекомбинантную плазмидную ДНК pERTPHO1, в качестве штамма-продуцента используют штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pERTPHO1, который культивируют в богатой среде, разрушение клеток проводят ультразвуком, затем отделяют растворимую фракцию. 2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pERTPHO1, кодирующая аминокислотную последовательность тимидин-фосфорилазы Escherichia coli, имеющая молекулярную массу 2,98 МДа, состоящая из NdeI/SalI-фрагмента ДНК плазмиды pET20b(+), содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, ген β-лактамазы, NdeI/SalI-фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность гена тимидин-фосфорилазы Escherichia coli, содержащая в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующей устойчивость сформированных плазмидой pERTPHO1 клеток Escherichia coli, к пенициллиновым антибиотикам, уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта NdeI: XbaI - 38 п.о., BglII - 96 п.о., PvuII - 741 п.о., PstI - 2288 п.о., PvuI - 2413 п.о., SalI - 4918 п.о. 3. Штамм Escherichia coli BL21(DE3) (ВКПМ В-7976), содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pERTPHO1 по п.2, продуцент тимидин-фосфорилазы.