СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АССОЦИИРОВАННОЙ С КЛЕТОЧНЫМИ ОБОЛОЧКАМИ ДЕНАТУРИРОВАННОЙ ГЕНОМНОЙ ДНК ДРОЖЖЕЙ ИЛИ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ Российский патент 2008 года по МПК C07H21/04 C12N15/10 

Изобретение относится к биохимии, а именно к методам выделения ДНК, конкретно к способу выделения ДНК из клеток дрожжей, грибов и микроорганизмов с прочной клеточной стенкой и может быть использовано для ПЦР-амплификации специфичных фрагментов микробных ДНК.

Подготовка биологического материала для ПЦР-амплификации предполагает разрушение клеток и освобождение внутриклеточной ДНК, а также очистку ДНК от белковых, липидных и прочих примесей, способных ингибировать ДНК-полимеразную реакцию.

Известен способ выделения ДНК, включающий использование лизоцима, додецилсульфата натрия, ЭДТА в качестве индукторов лизиса клеточной стенки с последующей депротеинизацией лизата хлороформом или фенолом и осаждением ДНК изопропанолом (Marmur. J.A. J. Mol. Biol. 1961. 3:208-218).

Известно использование литических ферментов (зимолиазы, литиказы и др.) для разрушения клеточных стенок дрожжей при получении образцов высокомолекулярной ДНК. (Muller P.M., Werner K.E., Kasai M., Francesconi A., Chanock S.J., Walsh T.J. Clim. Microbiol. 1998. 36(6): 1625-1629).

Известен способ выделения ДНК путем разрушения клеток грамположительных микроорганизмов и дрожжей с помощью 3% SDS (Polaina J., Adam A.C. Nucleic Acid Res. 1991. 19(19): 5443).

Все вышеперечисленные способы выделения ДНК достаточно трудоемки, дороги и занимают много времени.

Известен способ выделения ДНК, основанный на использовании буферных растворов, содержащих высокие концентрации солей-хаотропов типа гуанидинийтиоцианата, способных лизировать оболочки многих грамотрицательных микробов (Пат. США №5234809, МКИ С12N 01/68, опубл. 1993).

Недостатками известного способа являются невозможность использования клеток микроорганизмов, обладающих прочной клеточной стенкой, устойчивой к действию солей-хаотропов, длительность и трудоемкость процесса.

Известен наиболее близкий к заявленному способ выделения геномной ДНК из клеток микроорганизмов, состоящий в том, что обработку микроорганизмов, имеющих прочные клеточные стенки, проводят буферным раствором, содержащим соль-хаотроп (производные гуанидиния) в концентрации 4-8 М при нагревании реакционной смеси в течение 3-7 мин (Пат. РФ №2177035, МКИ С12N 15/10, опубл. 2001).

Вышеупомянутый способ является эффективным в отношении многих дрожжей, мицелиальных грибов и некоторых грамположительных микроорганизмов. Однако он неэффективен в отношении многих грамположительных бактерий, в том числе почвенных изолятов Bacillus subtilis, Arthrobacter globiformis и Micrococcus luteus, а также некоторых природных изолятов дрожжей, обладающих очень прочной и плотной клеточной стенкой, практически не пропускающей наружу внутриклеточные белки в ходе экстракции хаотропными растворами.

Изобретение решает задачу повышения эффективности процесса получения геномной ДНК, ассоциированной с прочными клеточными оболочками дрожжей и грамположительных бактерий.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе выделения геномной ДНК из клеток микроорганизмов и дрожжей, включающем обработку клеток буферным раствором с нейтральным рН, содержащим соль-хаотроп, выбранную из группы солей гуанидиния, при нагревании с последующим выделением целевого продукта дополнительно проводят обработку клеток буферным раствором, содержащим 50-100 мкг/мл протеиназы К, в течение 0,5-1,0 часа при 37-40°С.

В процессе обработки клеток солями-хаотропами и протеиназой К в заявленном способе происходит солюбилизация мембранных структур, полная денатурация и протеолитическая деградация внутриклеточных белков и белков клеточной стенки, и за счет этого достигается полная депротеинизация хромосомных ДНК и резко увеличивается проницаемость клеточной оболочки по отношению к макромолекулам (ДНК). В то время как белки, пептиды, липиды и другие компоненты диффундируют из клетки, хромосомная ДНК из-за своей большой длины остается внутри клеточной оболочки. Механизм сохранения ДНК внутри клеточных оболочек, предположительно, состоит в следующем.

В процессе тепловой обработки в присутствии солей-хаотропов происходит денатурация (плавление) хромосомной ДНК и ее частичное расщепление до одноцепочечных фрагментов размером 16-25 т.п.о. При последующем быстром охлаждении раствора денатурированная ДНК за счет комплементарных взаимодействий образует трехмерную пространственную сеть, не растворимую при комнатной температуре, - она не вымывается из клеточных оболочек в ходе двух промывок дистиллированной водой. В процессе последующей обработки ДНК-содержащих клеточных оболочек протеиназой К при 37-40°С хромосомная ДНК также практически не вымывается из клеточных оболочек - потери ДНК составляют менее 1%. Таким образом, денатурированная геномная ДНК, получаемая заявленным способом, прочно ассоциирована с клеточными оболочками и представляет собой матричную ДНК, обладающую такой же активностью в ПЦР, как и денатурированная геномная ДНК, не связанная с клеточными стенками. При этом заявленный способ получения матричной ДНК гораздо проще, дешевле и эффективней.

Установлено, что с помощью последовательной обработки клеток микроорганизмов, дрожжей и грибов сначала буферным раствором, содержащим соль-хаотроп, а затем - буферным раствором (рН 8,0), содержащим протеиназу К, можно простым, доступным и эффективным способом получать образцы матричных ДНК для ПЦР из дрожжей, грибов и грамположительных микроорганизмов, обладающих клеточными стенками повышенной плотности и прочности. Кроме того, получаемые образцы - суспензии ДНК-содержащих клеточных оболочек в 50%-ном этаноле можно хранить длительное время как при -20°С, так и при +4°С или при комнатной температуре.

Способ осуществляют следующим образом.

Клетки дрожжей выращивают в жидкой среде YPD (1,0% дрожжевой экстракт, 2,0% бактопептон, 2% глюкоза, рН 5,3) или на чашках с агаризованной средой YPD (1,5% агар) при 30°С, или на средах иного состава. Клетки грамположительных бактерий выращивают на чашках с L-агаром при 30 или 37°С или на жидких и твердых средах другого состава.

Клетки дрожжей или грамположительных бактерий суспендируют в буфере D при рН 7,0, содержащем соль-хаотроп 4 М гуанидинийтиоцианат, 25 мМ цитрата натрия, 0,1 М β-меркаптоэтанола, 0,5% саркозила или в буфере D-2, содержащем 4 М гуанидиний тиоцианата, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ EDTA, 0,1 М β-меркаптоэтанола, 0,5% саркозила, рН 8,0, или в буфере Е, содержащем 8М гуанидинийхлорид, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ EDTA, 0,1 М β-меркаптоэтанола, 0,5% саркозила, рН 8,0.

Клетки дрожжей (30-50 мг сырой биомассы) или 30 мг сырой биомассы грамположительных бактерий суспендируют в 300-500 мкл буфера D или D-2 или буфера Е и инкубируют на кипящей водяной бане в течение 5-10 мин или в температурном диапазоне от 50 до 100°С, преимущественно при 70°С в течение 15-30 мин. Клетки осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 60 секунд на центрифуге Eppendorf. Супернатант выбрасывают. Клеточные осадки дважды промывают в 1 мл дистиллированной или деионизованной воды. Клеточные осадки после второй промывки суспендируют в буфере, содержащем 25 мМ Трис-HCl, 10 мМ EDTA, 0,5% саркозила (или 0,3% SDS) и 50-100 мкг/мл протеиназы К.

Смесь инкубируют 0,5-1,0 час при 37-40°С, а затем центрифугируют 2-3 минуты при 12000 об/мин. Супернатант выбрасывают, а осадок дважды промывают дистиллированной водой по 1 мл и затем суспендируют в 300 мкл 50%-ного этанола. Полученную суспензию ДНК-содержащих клеточных оболочек (образцов матричных ДНК) хранят при -20°С, либо при +4°С, или при комнатной температуре и используют непосредственно в экспериментах по ПЦР амплификации. В полученных суспензиях титр клеток (ДНК-содержащих клеточных оболочек) составляет 5·10⁸-1·10⁹. В опыт берут 1 мкл неразведенной клеточной суспензии или 1 мкл из 10^-1-10^-2 разведений на 50 мкл реакционной смеси для ПЦР.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1.

Клетки дрожжей S.cerevisiae (штамм Н 190, ИБХ РАН) выращивают в жидкой среде YPD (1% дрожжевого экстракта, 2,0% бактопептона, 2% глюкозы, рН 5,3).

30 мг сырой биомассы клеток дрожжей суспендируют в 400 мл буфера Е и инкубируют на кипящей водяной бане в течение 7 мин. Клетки осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 60 секунд на центрифуге Eppendorf. Супернатант выбрасывают. Клеточные осадки дважды промывают в 1 мл дистиллированной воды. Клеточные осадки после второй промывки суспендируют в буфере, содержащем 25 мМ Трис-HCl, 10 мМ EDTA, 0,5% саркозила и 50 мкг/мл протеиназы К. Смесь инкубируют 1 час при 37°С, затем центрифугируют 2-3 минуты при 12000 об/мин. Супернатант переносят в чистую пробирку, а осадок дважды промывают дистиллированной водой (1 мл). Супернатанты после двух промывок водой также сохраняют, а полученный осадок суспендируют в 300 мкл 50%-ного этанола.

Пример 2.

Клетки дрожжей Р.pastoris (штамм GS 115, ИБХ РАН) выращивают на чашках с агаризованной средой YPD (1,5% агара) при 30°С.

50 мг сырой биомассы дрожжей суспендируют в 500 мл буфера D-2 и инкубируют на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Клетки осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 60 секунд на центрифуге Eppendorf. Супернатант выбрасывают. Клеточные осадки дважды промывают 1 мл деионизованной воды. Клеточные осадки после второй промывки суспендируют в буфере, содержащем 25 мМ Трис-HCl, 10 мМ EDTA, 0,3% SDS и 100 мкг/мл протеиназы К. Смесь инкубируют 0,5 часа при 37°С, затем центрифугируют 2-3 минуты при 12000 об/мин. Супернатант переносят в чистую пробирку, осадок дважды промывают дистиллированной водой (по 1 мл) и после этого суспендируют в 300 мкл 50%-ного этанола.

Пример 3.

Клетки клинических изолятов дрожжей, принадлежащие к родам Candida, Trichosporon или Rhodotorula, выращивают на чашках с соответствующей средой при 37°С. 40 мг сырой биомассы дрожжей суспендируют в 500 мл буфера D-2 и инкубируют на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Клетки осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 60 секунд на центрифуге Eppendorf. Супернатанты выбрасывают. Клеточные осадки дважды промывают в 1 мл деионизованной воды. Клеточные осадки после второй промывки суспендируют в буфере, содержащем 25 мМ Трис-HCl, 10 мМ EDTA, 0,3% SDS и 75 мкг/мл протеиназы К. Смесь инкубируют 0,5 часа при 37°С, затем центрифугируют 2-3 минуты при 12000 об/мин. Супернатанты переносят в чистые пробирки, осадок дважды промывают дистиллированной водой (по 1 мл) и после этого суспендируют в 300 мкл 50%-ного этанола.

Пример 4.

Клетки природных изолятов психрофильных дрожжей, принадлежащих к роду Leucosporidium, выращивают на соответствующей питательной среде при 9-20°С в течение 1-2 недель.

40 мг сырой биомассы дрожжей суспендируют в 500 мл буфера D-2 и инкубируют на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Клетки осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 60 секунд на центрифуге Eppendorf. Супернатанты выбрасывают. Клеточные осадки дважды промывают 1 мл деионизованной воды. Клеточные осадки после второй промывки суспендируют в буфере, содержащем 25 мМ Трис-HCl, 10 мМ EDTA, 0,3% SDS и 50 мкг/мл протеиназы К. Смесь инкубируют 0,5 часа при 37°С, затем центрифугируют 2-3 минуты при 12000 об/мин. Супернатанты переносят в чистые пробирки, осадок дважды промывают дистиллированной водой (по 1 мл) и после этого суспендируют в 300 мкл 50%-ного этанола.

Пример 5.

Клетки грамположительных бактерий A.globiformis, В.subtilis (штамм ВКМ В-504) или М.luteus (штамм NCIMB 13267) выращивают на чашках с L-агаром при 37°С.

30 мг сырой биомассы клеток микроорганизмов суспендируют в 500 мл буфера D-2 и инкубируют на кипящей водяной бане в течение 8 мин. Клетки осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 60 секунд на центрифуге Eppendorf. Супернатант выбрасывают. Клеточные осадки дважды промывают 1 мл дистиллированной воды. Клеточные осадки после второй промывки суспендируют в буфере, содержащем 25 мМ Трис-HCl, 10 мМ EDTA, 0,5% саркозила и 50 мкг/мл протеиназы К. Смесь инкубируют 0,5 часа при 37°С, затем центрифугируют 2-3 минуты при 12000 об/мин. Супернатант переносят в чистую пробирку, осадок дважды промывают дистиллированной водой (по 1 мл) и после этого суспендируют в 300 мкл 50%-ного этанола.

Пример 6.

Клетки грамположительных бактерий A.globiformis или В.subtilis (штамм ВКМ В-504) выращивают на чашках с L-агаром при 37°С.

30 мг сырой биомассы клеток микроорганизмов суспендируют в 500 мл буфера D-2 и инкубируют в термостате при 70°С в течение 20 мин. Клетки осаждают центрифугированием при 12000 об/ мин в течение 60 секунд на центрифуге Eppendorf. Супернатант выбрасывают. Клеточные осадки дважды промывают 1 мл дистиллированной воды. Клеточные осадки после второй промывки суспендируют в буфере, содержащем 25 мМ Трис-HCl, 10 мМ EDTA, 0,5% саркозила и 50 мкг/мл протеиназы К. Смесь инкубируют 1,0 час при 37°С, затем центрифугируют 2-3 минуты при 12000 об/мин. Супернатант переносят в чистую пробирку, осадок дважды промывают дистиллированной водой (по 1 мл). Супернатанты после двух промывок водой также сохраняют. После второй промывки осадки суспендируют в 300 мкл 50%-ного этанола.

Все супернатанты, полученные при обработке каждого образца клеточных оболочек протеиназой К и их промывке водой, объединяют вместе (получается 2,4-2,5 мл) и в суммарном растворе измеряли поглощение при 260 и 280 нм с тем, чтобы оценить количество экстрагируемых белков (пептидов). Концентрацию белка определяют по формуле С (мг/мл) = 1,55 Е₂₈₀ - 0,76 E₂₆₀ (Досон Р., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. // Справочник Биохимика. М.: Мир, 1991. С.464).

Для изучения выхода нуклеиновых кислот (НК) из клеток в процессе обработки протеиназой К и водных промывок, отбирают аликвоты из объединенных супернатантов (обычно 0,5 мл из 2.5 мл), к ним добавляют 2V 96% этанола. Смесь центрифугируют при 12000 об/мин в течение 5 мин. Полученные при этом осадки, содержащие НК, подсушивают на воздухе, растворяют в 30 мкл дистиллированной Н₂О. Наличие НК в полученных растворах тестируют электрофоретически. На электрофорез в каждую лунку геля наносят по 10 мкл раствора.

Согласно данным спектрофотометрического анализа объединенные супернатанты содержат значительное количество белка (пептидов) (до 1 мг и выше для каждого образца). При этом уровень экстракции белка зависит от времени инкубации клеточных оболочек с протеиназой К. Эти данные свидетельствуют о том, что протеиназа К легко проникает через клеточную стенку дрожжей и бактерий и эффективно расщепляет денатурированные в ходе обработки солями-хаотропами белки до низкомолекулярных пептидов. Последние затем легко просачиваются наружу.

Было исследовано также наличие НК (ДНК и РНК) у объединенных супернатантов после действия протеиназы К. Как следует из результатов электрофоретического анализа (электрофореза полученных образцов в 1% агарозном геле), в супернатантах, соответствующих клеточным оболочкам всех исследованных микроорганизмов (т.е. дрожжей всех видов и грамположительных бактерий) полностью отсутствует геномная ДНК. Иными словами, денатурированная после кипячения с солями-хаотропами геномная ДНК при последующей обработке протеиназой К и промывке дистиллированной водой практически не теряется (не выходит из клеток). Исследуемые супернатанты в то же время содержат некоторое количество РНК.

Полученные с помощью протеиназы К клеточные оболочки с денатурированной ДНК были далее исследованы в ПЦР с универсальными праймерами к генам рибосомных РНК. В ПЦР с клеточными оболочками грамположительных бактерий использовали универсальные праймеры к консервативным участкам генов рибосомных РНК эубактерий 27f: (5′) AGAGTTTGATCCTGGCTCAG и 1522r: (5′) AAGGAGGTGATCCARCCGCA (Johnson J.L. Similarity analysis of RNAs. In P. Gerhardt, R.G.E. Murray, W.A. Wood, and N.R. Krieg (ed.) Methods for general and molecular bacteriology. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1994. P.683-700).

Условия ПЦР: денатурация - 93°С, 30 с, отжиг - 60°С, 30 с, синтез - 72°С, 60 с. Число циклов - 27-33.

В ПЦР на клеточных оболочках дрожжей использовали универсальные праймеры к консервативным участкам рДНК 5,8S-R: (5′) TCGATGAAGAACGCAAGC и LR3: (5′) GGTCCGTGTTTCAAGAC (Vilgalys R., Hester M. // J.Bacteriol. 1990. V.172. P.4238-4246). Условия ПЦР: денатурация - 93°С, 30 секунд, отжиг - 55°С, 30 секунд, синтез - 72°С, 40 секунд. Число циклов - 30-35.

Электрофорез в 1% агарозном геле показал, что в ходе ПЦР с клеточными облочками грам положительных бактерий и праймерами 27f+1522r во всех трех случаях образуется фрагмент ДНК одного и того же размера (˜1500 п.о.) (в реакционную смесь объемом 50 мкл вносили по 1 мкл суспензии клеточных оболочек, число циклов ПЦР в данном опыте составляло 30). При этом продукты ПЦР были получены и в том случае, когда суспензию ДНК-содержащих клеточных оболочек развели в 100, 1000 раз, а число циклов увеличили до 33. Необходимо отметить, что при использовании ДНК-содержащих клеточных оболочек тех же бактерий, полученных путем кипячения в буфере D в течение 10 минут (но без обработки протеиназой К) продукты ПЦР вообще не удавалось получить даже при 40 термальных циклах. Таким образом, после обработки протеиназой К образующиеся клеточные оболочки грамположительных бактерий, содержащие денатурированную ДНК, весьма эффективны как матрицы в ПЦР.

Сходные результаты получены на клеточных оболочках дрожжей. Клеточные оболочки всех изученных штаммов, содержащие денатурированную ДНК, весьма эффективны как матрицы в ПЦР. В присутствии праймеров 5.8SR и LR3 и соответствующих клеточных оболочек (т.е. матричной ДНК) происходит амплификация межгенного участка (спейсера) IST2 и области D1/D2 26S субъединицы рДНК (Vilgalys R., Hester M. // J.Bacteriol. 1990. V.172. Р.4238-4246). Изучение тонкой структуры фрагментов рДНК - продуктов ПЦР (например, с помощью рестриктного анализа или секвенирования) используется в геносистематике грибов. Размер продуктов ПЦР для штаммов S. cerevisiae и Р. pastoris в эксперименте соответствовал 900 и 500 п.н., что хорошо совпадает с литературными данными (Данилевич В.Н., Гришин Е.В. // Биоорганическая химия. 2002. Т.28. №2. С.156-167).

Таким образом, обработка ДНК-содержащих клеточных оболочек дрожжей и грамположительных бактерий протеиназой К резко увеличивает проницаемость их клеточных стенок по отношению к ДНК, т.е. облегчает диффузию фрагментов ДНК из клеток наружу при использовании в качестве матрицы в ПЦР.

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии и может быть использовано при создании тест-систем различного назначения, предполагающих использование ПЦР-амплификации ДНК из клеток дрожжей, грибов и микроорганизмов с особо прочной клеточной стенкой. Предложен способ выделения геномной ДНК дрожжей и грамположительных бактерий, ассоциированной с клеточными оболочками и пригодной для непосредственного использования в ПЦР-амплификации. Способ по изобретению предусматривает обработку клеток буферным раствором с нейтральным рН, содержащим соль-хаотроп, выбранную из группы солей гуанидиния, при нагревании с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что перед выделением ДНК дополнительно обрабатывают клеточный осадок буферным раствором, содержащим 50-100 мкг/мл протеиназы К, в течение 0,5-1,0 часа при 37-40°С. Осуществление изобретения позволяет повысить эффективность процесса получения геномной ДНК и включить в круг источников микроорганизмы с особо прочной клеточной стенкой.

Способ получения ассоциированной с клеточными оболочками денатурированной геномной ДНК дрожжей или грамположительных бактерий, обладающей матричной активностью в ПЦР, который включает обработку клеток буферным раствором с нейтральным рН, содержащим соль-хаотроп, выбранную из группы солей гуанидиния, при нагревании с последующей промывкой клеточного осадка и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что после промывки дополнительно проводят обработку клеточного осадка буферным раствором с рН 7,5-8,0, содержащим 50-100 мкг/мл протеиназы К, в течение 0,5-1,0 ч при 37-40°С.