СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ МЕТГЕМОГЛОБИНА В КРОВИ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/72 G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, а именно к судебной медицине.

В последние десятилетия во всем мире отмечается значительное увеличение острых отравлений различными химическими соединениями. Ежегодно в странах СНГ регистрируется около 1 миллиона острых отравлений, из ниx смертельных - более 50 тысяч (Е. А. Лужников, В.Н.Дагаев, 1990, Ю.И.Журавлев с соавт., 1990).

По данным Ивановского областного Бюро судебно-медицинской экспертизы за 1999 год в областном центре умерло 8 человек от острого отравления нитросоединениями. Анализ смертельных и несмертельных отравлений выявляет неспецифичность морфологических и клинических проявлений отравления, сложность интерпретации результатов биохимического исследования трупной крови на метгемоглобин, особенно при гнилостных изменениях трупа.

Окисление двухвалентного железа гемоглобина в трехвалентное (образование метгемоглобина) сопровождается изменением окраски раствора. Различия в окрасках, а значит и в спектрах поглощения между оксигемоглобином и метгемоглобином явились основой для разработки методов спектрофотометрического анализа.

В литературе описано множество методов спектрофотометрического определения метгемоглобина крови (Heimeyer 1933; И.M.Tpaxтeнберг, Е.А.Безнадежных, И. В.Савицкий, 1957; М. А.Рождественская 1957; Е.Е.Бадюк, 1960; К.С.Косяков. 1959; Г. В. Дервиз 1966 и др. Лабораторное дело, 1966, 8, с. 461), сущность которых заключается в следующем: стандартным способом готовится 1% раствор крови в дистиллированной воде, освобожденный от стром. Измеряют величину оптической плотности полученного раствора в кюветах 10 мм при длине волны 540, 560, 575, 630 нм. В качестве раствора сравнения используют дистиллированную воду. После измерения в ту же кювету добавляется несколько кристаллов феррицианида калия для превращения всего гемоглобина в метгемоглобин, а затем 1 каплю 10% раствора ацетонцианатгидрина - для образования цианметгемоглобина и тщательно перемешивают. Затем вновь измеряют оптическую плотность полученного раствора при 540 нм. Далее в отдельном стакане определяется рН раствора. Таким образом, вся процедура состоит из: 1) приготовления раствора крови; 2) определения концентрации общего гемоглобина; 3) определения рН исследуемого раствора; 4) измерения его оптической плотности; 5) перевода всего гемоглобина в растворе в метгемоглобин и определения оптической плотности данного раствора; 6) вычисления концентрации метгемоглобина в исследуемом растворе по различию до и после реакции с феррицианидом калия, с учетом рН среды.

Технический результат предлагаемого способа определения концентрации метгемоглобина в крови заключается в том, что измерение оптической плотности производится однократно и отпадает необходимость дважды измерять оптическую плотность исследуемого раствора (до и после реакции с феррицианидом калия), не учитывая влияния рН среды и концентрацию общего гемоглобина, и поэтому нет необходимости в их определении.

Сущность предлагаемого нами способа определения концентрации метгемоглобина в крови состоит в следующем. Для калибровки прибора спектрофотометр "Specord М-400" берут 1 мл крови, не содержащей метгемоглобин, смешивают с 70 мл 0,1% раствора аммиака, центрифугируют в течение 10 мин при 2500 об/мин, фильтруют чеpeз бумажный фильтр и снимают спектр полученного раствора в области 500-700 нм, используя в качестве сравнения 0,1% раствор аммиака. После снятия спектра в кювету с исследуемым раствором добавляют 1 каплю насыщенного водного раствора феррицианида калия. Содержимое кюветы тщательно перемешивают, выдерживают в течение 10 мин и снимают спектр данного раствора. Полученные спектры имеют две изосбестические точки при 524 и 585 нм (оптическая плотность растворов не зависит от соотношения гемоглобина и его дериватов). При математической обработке полученных спектров установлено, что дифференциальный спектр имеет максимум поглощения при 600 нм, оптическая плотность метгемоглобина при данной длине волны равна 0,8647 единиц оптической плотности (ЕОП). Остaточное поглощение оксигемоглобина при данной длине волны равно 0,1481 ЕОП. Оптическая плотность растворов окси- и метгемоглобина при 524 нм равна 1,3359 ЕОП, при 585 нм - 1,4048 ЕОП. Для определения концентрации метгемоглобина 1 мл исследуемой крови смешивают с 70 мл 0,1% раствора аммиака, центрифугируют при 2500 об/мин в течение 10 мин, фильтруют через бумажный фильтр. Измеряют оптическую плотность полученного раствора при 524, 585 и 600 нм в кювете толщиной 10 мм, используя в качестве раствора сравнения 0,1% раствор аммиака.

Расчет производится по формуле:

где Х% - концентрация метгемоглобина в исследуемой крови;
Дкр - оптическая плотность исследуемого раствора при 600 нм;
Дhb₀₂ - остаточное светопоглощение оксигемоглобина раствора крови, использованной для калибровки при 600 нм (0,1481);
Дmethb•100% - оптическая плотность 100% метгемоглобина раствора крови, использованной для калибровки при 600 нм (0,8647);
К - коэффициент пересчета, учитывающий отличие в содержании гемоглобинов в исследуемой крови, использованной от калибровки прибора, который вычисляется по формуле:

где Dиссл 524 - оптическая плотность исследуемой крови при 524 нм;
Dиссл 585 - оптическая плотность исследуемой крови при 585 нм,
Dкалибр 524 - оптическая плотность крови, использованной для калибровки при 524 нм (1,3359);
Dкалибр 585 - оптическая плотность крови, использованной для калибровки при 585 нм (1,4048).

Знаменатель формулы - "D калибр 524+ D калибр 585" - величина постоянная и равна 2,741.

Таким образом, отличительной особенностью предложенного способа отделения концентрации метгемоглобина в крови является то, что для проведения анализа используются коэффициенты остаточного светопоглощения, вычисленные на основании дифференциального спектра смеси окси- и метгемоглобина в точках, для которых оптическая плотность раствора не зависит от их соотношения. В расчетную формулу вводится коэффициент, учитывающий отличие исследуемой крови от раствора крови, используемого при калибровке, что позволяет проводить однократную калибровку прибора.

Пример. Больной Г., 45 лет, поступил по направлению скорой медицинской помощи в нейрохирургическое отделение областной клинической больницы с подозрением на черепно-мозговую травму. Из анамнеза известно, что дома он внезапно упал, потерял сознание. Накануне употреблял алкоголь. При поступлении: состояние крайне тяжелое, сознание угнетено до уровня глубокой комы. Брадипноэ до 8-10 в мин. Очаговой неврологической симптоматики не определялось. Из наружных повреждений - кровоподтек в левой околоушной области. Поставлен диагноз ЗЧМТ, ушиб головного мозга. На фоне проводимой интенсивной терапии (инфузионная, дегидратационная, кортистероидная) через один час наступила смерть. При наружном исследовании трупа отмечено: трупные пятна разлитые, с коричневатым оттенком, желтушность склер, в локтевой ямке располагается точечная рана (след внутривенной инъекции), от которой отходит подсохший потек темно-коричневой крови. При внутреннем исследовании трупа: выраженный отек - набухание мозга, геморрагический отек легких, кровоизлияния под легочной плеврой, эпикардом, острое венозное полнокровие внутренних органов, в полостях сердца и крупных сосудов темно-коричневая кровь, положительная качественная реакция на нитриты с содержимым желудка и мочой. Судебно-медицинский диагноз: острое отравление метгемоглобинобразующим ядом (нитратами).

С целью определения концентрации метгемоглобина проводилось исследование крови, взятой из трупа по предлагаемой методике: оптическая плотность крови при 524 нм составила 0,8223 ЕОП, при 585 нм - 0,8336 ЕОП, при 600 нм - 0,3678 ЕОП.

Вычисления:
1. Определение коэффициента перecчeтa К=(0,8223+0,8336)/2,741=0,6041
2. Определение концентрации метгемоглобина

Таким образом, концентрация метгемоглобина в крови, взятой из трупа гражданина Г. , составила 53,28%, что полностью подтверждает судебно-медицинский диагноз.

Изобретение относится к медицине, а именно к судебной медицине. Способ обеспечивает повышение точности определения концентрации метгемоглобина в крови. Проводят однократное изменение оптической плотности раствора крови с последующим расчетом концентрации метгемоглобина в исследуемой крови по формуле: где Х% - концентрация метгемоглобина в исследуемой крови; Дкр - оптическая плотность исследуемого раствора при 600 нм; Дhb₀₂ - остаточное светопоглощение оксигемоглобина раствора крови, использованной для калибровки при 600 нм (0,148); Дmethb•100% - оптическая плотность 100% метгемоглобина раствора крови, использованной для калибровки при 600 нм (0,8647); К -коэффициент пересчета, учитывающий отличие в содержании гемоглобинов в исследуемой крови, использованной от калибровки прибора.

Способ определения концентрации метгемоглобина в крови, основанный на вычислении концентрации метгемоглобина в исследуемой крови с использованием спектрофотометрического метода, отличающийся тем, что проводят однократное измерение оптической плотности раствора крови с последующим расчетом концентрации метгемоглобина в крови по формуле

где Х% - концентрация метгемоглобина в исследуемой крови;
Дкр - оптическая плотность исследуемого раствора при 600 нм;
Дпb_о2 - остаточное светопоглощение оксигемоглобина раствора крови, использованной для калибровки при 600 нм (0,148);
Дmethb х 100% - оптическая плотность 100% метгемоглобина раствора крови, использованной для калибровки при 600 нм (0,8647);
К - коэффициент пересчета, учитывающий отличие в содержании гемоглобинов в исследуемой крови, использованной от калибровки прибора.