СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ОСНОВНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ГЕМОГЛОБИНА Российский патент 1999 года по МПК G01N33/52 G01N33/72 

Изобретение относится к медицинской диагностике в области гематологии и может быть использовано для контроля газового состава крови в реанимации, токсикологии, при интенсивной терапии, для определения влияния на газовый состав гемоглобина факторов внешней среды (экологической обстановки, радиационного воздействия), в космической медицине. Способ может быть основой для создания простого и надежного прибора.

Известен способ и устройство для определения оксигенации гемоглобина в оптически доступных тканях (Патент США N 5318122, МПК A 61 B 5/00, 6/00).

Для проведения оксиметрии исследуют избранную зону ткани с помощью коллимированного зондирующего света, по меньшей мере, двух определенных длин волн в полосе поглощения гемоглобина вокруг изобестической длины волны поглощения около 501 нм. По меньшей мере, одна длина волны приближена к изобестической и, по меньшей мере, одна неизобестическая. Определяют отражение зондирующего света от ткани для каждой длины волны и обеспечивают соответствующие отражению интенсивности сигналов. В соответствии с интенсивностями сигналов отражения определяют адекватные насыщению кислородом коэффициенты отражения для изобестической и неизобестической длин волн, представляющие оксигенацию гемоглобина.

Недостатком этого способа является определение лишь степени оксигенации гемоглобина, не позволяющее проводить более полную диагностику состояния пациента. Кроме того, при расчетах пренебрегают содержанием карбоксигемоглобина и метгемоглобина, что в некоторых случаях существенно снижает точность оксиметрии. Способ не может быть использован при исследовании патологических состояний.

Известен также способ анализа газового состава крови (Патент США N 5355880, A 61 B 5/00).

Анализ газового состава крови в живом организме осуществляют измерением интенсивности поглощения света препаратом при освещении тремя различными источниками света в диапазоне 500-2500 нм. При этом величина интенсивности поглощения света для каждого из препаратов зависит от величины pH, концентрации HCO₃ ^-, pCO₂, pO₂ и насыщения кислородом. После определения, по меньшей мере, двух значений для величин pH, HCO₃ и pO₂, по данным величинам интенсивности поглощения с большой степенью достоверности могут быть рассчитаны значения содержания кислорода в анализируемой функции.

Недостатком этого способа является определение лишь содержания кислорода в анализируемом препарате, что существенно снижает информативность данного способа. Способ не применим при некоторых патологических состояниях.

Известен способ и устройство для прямого спектрофотометрического измерения в цельной неизмененной крови (Заявка PCT(WO) N 94/08237, МПК G 01 N 33/48).

Предложен способ и устройство для точного спектрофотометрического определения концентраций различных видов гемоглобина в цельной крови без гемолиза или разбавления.

Для устранения сложных оптических свойств цельной крови в способе предусмотрено применение оптического устройства 10, 11, 12, 13 и 14, предназначенного для оптимизации измерений и позволяющего определить истинную оптическую плотность цельной крови и уменьшить влияние светового рассеяния на спектрофотометрическое измерение концентрации различных составляющих компонентов, и коррекции измерений концентрации гемоглобина с учетом светового рассеяния и влияния конечной ширины полосы преимущественно монохроматического света. В оптическом устройстве 10-14 (включая оптическую кювету 11) все оптические параметры, такие как толщина образца, форма и размер детектора, расстояние между образцом и детектором, длина волны, монохроматичность, максимальный угол захвата света детектором, являются оптимальными для уменьшения доли светового рассеяния в общем оптическом затухании цельной неизмененной крови и увеличения доли истинной оптической плотности.

Недостатком данного способа является сложность измерительной аппаратуры, что затрудняет применение в широкой клинической практике.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ определения относительных концентраций производных гемоглобина (авторское свидетельство 1613955, G 01 N 33/49), включающий помещение проб крови в две кюветы с различной величиной оптического пути, измерение коэффициентов диффузионного отражения и относительного пропускания двух слоев, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, фотометрирование производят при длинах волн 660, 700, 805 нм с последующим расчетом относительных концентраций мет-, окси-, и дезоксигемоглобина по формуле

где оптические плотности слоя крови;
n = 1,2,3 - индексы, относящиеся к длинам волн λ₁ = 660 нм, λ₂ = 700 нм, λ₃ = 805 нм;
показатели поглощения слоя крови, определяемые из выражения

где параметры, определяемые по величине коэффициентов диффузионного отражения одного из слоев крови из соотношения

коэффициент диффузного пропускания слоя крови с толщиной l' = 0.1 см;
коэффициент диффузного пропускания слоя крови с толщиной l''=0.14 см;
l' - толщина слоя крови = 0.1 см;
l'' - толщина слоя крови = 0.14 см;
миллимолярные показатели поглощения метгемоглобина;
a - относительная концентрация метгемоглобина;
миллимолярные показатели поглощения дезоксигемоглобина;
b - относительная концентрация дезоксигемоглобина;
миллимолярные показатели поглощения оксигемоглобина.

c - относительная концентрация оксигемоглобина;
Достоинством этого способа является учет при расчетах диффузионного рассеяния, что повышает точность получаемых результатов; а также определение трех производных гемоглобина, в том числе метгемоглобина, что позволяет использовать данный способ при ряде острых отравлений.

Известный способ не предусматривает определение содержания карбоксигемоглобина, а также абсолютных концентраций исследуемых производных гемоглобина, что существенно снижает в большинстве случаев информативность способа; кроме того, использование цельной крови повышает требования к измерительной аппаратуре.

Задачей настоящего изобретения является создание способа определения содержания основных производных гемоглобина, обеспечивающего измерение четырех составляющих гемоглобина, в том числе карбоксигемоглобина, упрощение измерительной аппаратуры и повышение точности анализа.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе определения содержания основных производных гемоглобина, основанном на фотометрировании проб крови на нескольких длинах волн видимого диапазона, отличающийся тем, что определение оптической плотности гемолизированных однопроцентных растворов крови проводят на m ≥ n длинах волн, выбранных методами линейного программирования и информационных коэффициентов, в диапазоне 450 - 650 нм, расчет концентраций производных гемоглобина, в частности оксигемоглобина, дезоксигемоглобина, карбоксигемоглобина, метгемоглобина проводят по известным молярным коэффициентам поглощения из системы уравнений вида:
(1)
где - оптическая плотность раствора крови на i-й длине волны;
ελj

Решение переопределенной системы (1) производят с помощью специально созданного программного обеспечения, включающего методы наименьших квадратов (МНК), линейного программирования (МЛП), алгебраической коррекции фона (АКФ) и объединенные методы, включающие МЛП и АКФ.

Способ поясняется графиками и таблицами, где на фиг.1 изображена спектральная зависимость миллимолярных коэффициентов поглощения основных производных гемоглобина (1-оксигемоглобина, 2-дезоксигемоглобина, 3-карбоксигемоглобина, 4-метгемоглобина);на фиг.2 изображена зависимость содержания основных производных гемоглобина от степени никотиновой интоксикации для мужчин (1 - некурящий пациент, 2 - курящий пациент); на фиг.3 изображена зависимость суммы рассчитанных концентраций производных гемоглобина от значения общей концентрации гемоглобина, определенной стандартным цианметгемоглобиновым методом.

Способ определения содержания основных производных гемоглобина осуществляется следующим образом.

При исследовании использовались образцы гепаринизированной крови, взятой из локтевой вены. Во избежание потерь эритроцитов центрифугирование не производилось. 1% раствор крови готовился следующим образом: к 20 мл дистиллированной воды добавляли 0.06 мл 0.04% раствора аммиака (для просветления раствора) и 0.5 мл крови, через 1-2 минуты (после гемолиза) добавляли 25 мл 0.0667 М KH₂PO₄/0.0667 М Na₂HPO₄ • 2H₂O, pH 7.2. Общий объем раствора доводили дистиллированной водой до 50 мл. Регистрация спектров поглощения производилась на шести длинах волн в диапазоне 450-650 нм в кварцевой кювете с оптической длиной пути 1.001 см на двухлучевом спектрофотометре СФ-20М с автоматической регулировкой ширины щели. В качестве раствора сравнения использовался вышеописанный буферный раствор. Измерения производились в течение 1 часа после забора крови.

Расчет содержания производных гемоглобина сводится к решению системы уравнений Фирордта:

где i = 1, 2, ..., m;
m - число аналитических длин волн;
n - число определяемых компонентов;
молярные коэффициенты поглощения (м.к.п.) для j-го компонента на длине волны λ_i;
c_j - определяемая концентрация j-го компонента;
оптическая плотность на длине волны
Из-за сложности объекта исследования (перекрывание спектров анализируемых производных, практически полное подобие спектров оксигемоглобина и карбоксигемоглобина, число компонент равное четырем) применение простых спектрофотометрических методов анализа не приводит к необходимой точности.

Проблему можно решить переходом к переопределенным системам линейных алгебраических уравнений (т.е. СЛАУ с m > n).

Существуют различные методы для решения переопределенных СЛАУ. Эти методы различаются критерием, которому наилучшим образом должно соответствовать получаемое решение. Различные решения, полученные с помощью разных критериев, могут принципиально отличаться друг от друга. Расчеты по этим методам очень трудоемки и требуют больших временных затрат. С целью преодоления указанных трудностей и усовершенствования способа создано специальное программное обеспечение, включающее методы наименьших квадратов (МНК), линейного программирования (МЛП), алгебраической коррекции фона (АКФ) и объединенные методы, включающие МЛП и АКФ.

При анализе использовались миллимолярные показатели поглощения (работа Sigaard-Andersen J. , Norgaard-Pedersen О.В., Rem 1. (1972) Hemoglobin pigments II: Photometer for oxygen saturation, carboxyhemoglobin, and methemoglobin in cappilary blood, in Clinica; (Chimica Acta), 42, pp. 101-108), показанные на фиг. 1. Выбор аналитических длин волн производился с помощью метода информационных коэффициентов. Для оценки оптимальности набора аналитических длин волн и величины погрешности анализа строится матрица информационных коэффициентов, состоящая из элементов вида:

Элемент R_ij показывает, какую долю информации несет i-я линия при определении j-й компоненты смеси. Чем выше информационные коэффициенты, тем меньше погрешности найденного решения. Также при определении аналитических длин волн использовались разности вида

и отношения вида

с целью выбора точек максимального различия в спектрах оксигемоглобина и карбоксигемоглобина (из-за причин, указанных выше). Затем полученный набор длин волн исследовался с помощью МЛП. Состав набора варьировался в процессе анализа. Длины волн, не оказывавшие влияния на результат, удалялись из набора. Еще одним критерием выбора являлся минимум разности между экспериментальным и редуцированным спектром на определенной длине волны.

Тестирование способа проведено на растворах с известным содержанием компонентов. В качестве эталонных растворов использовались трехкомпонентные смеси, содержащие хлориды кобальта, хрома и никеля, которые имеют перекрывающиеся спектры поглощения. Сравнительные результаты приведены в табл.1.

Хорошее совпадение результатов анализа с эталонными значениями свидетельствует об эффективности применения способа и свидетельствует о возможности исследования сложных растворов с перекрывающимися спектрами поглощения компонентов. Проведено исследование газового состава растворов цельной крови с помощью программных средств по спектрам поглощения многокомпонентных смесей производных гемоглобина, содержащих HbO₈, Hb, Hb(CO)₄, MetHb. Результаты представлены в табл.2.

Для иллюстрации разработанной методики получена зависимость концентраций производных гемоглобина от степени никотиновой интоксикации для мужчин. Полученные результаты приведены на фиг.2, которая наглядно показывает негативные изменения в организме человека (уменьшение содержания оксигемоглобина, обусловленное повышением концентрации карбоксигемоглобина, и как следствие этого - падение степени оксигенации гемоглобина).

Проведена экспериментальная оценка точности разработанного способа определения содержания основных производных гемоглобина. Критерием правильности расчетов концентраций производных гемоглобина служило совпадение суммы концентраций производных гемоглобина, рассчитанных по данной методике, со значением общей концентрации гемоглобина в том же образце крови, определенной стандартным цианметгемоглобиновым методом. На фиг.3 представлена зависимость рассчитанной суммы концентраций производных гемоглобина от значения общей концентрации гемоглобина. Коэффициент наклона аппроксимирующей прямой равен 0.997, достоверность аппроксимации 0.987, что подтверждает хорошее соответствие результатов.

Разработанный способ применим к количественному спектрофотометрическому анализу любых химических систем с перекрывающимися спектрами поглощения компонентов. На основе предложенного способа может быть создан специализированный многоволновый модуль с фиксированным набором аналитических длин волн для применения в клинической практике.

Пример. Раствор крови, приготовленный по вышеописанной методике, помещался в кювету. Измерения на аналитических длинах волн показали следующие результаты для оптической плотности: D¹= 1.308; D²=0.4696; D³=1.0234; D⁴= 0.9128; D⁵=0.7853; D⁶=1.075.

Миллимолярные коэффициенты поглощения, используемые для каждой длины в л/(ммоль•см):

С помощью программного обеспечения произведен расчет содержания окси-, дезокси-, карбокси- и метгемоглобина и получены следующие результаты в единицах г/100 мл (в %):
10.9319 (79.50); C_Hb = 2.3828 (17.38); = 0.2576 (1.93); C_MetHb = 0.1610 (1.19).

Способ может быть использован в медицинской диагностике в области гематологии для контроля газового состава крови. Для определения содержания основных производных гемоглобина используют гемолизированные 1%-ные растворы крови. Измерение спектров поглощения проводят на спектрофотометре при шести аналитических длинах волн в диапазоне 450-650 нм. Последующий расчет концентраций оксигемоглобина, дезоксигемоглобина, карбоксигемоглобина и метгемоглобина по измеренной оптической плотности происходит с помощью программного обеспечения. Способ может быть основой для создания простого и надежного прибора. Способ позволяет упростить измерительную аппаратуру и повысить точность анализа. Разработанный способ применим к количественному спектрофотометрическому анализу любых химических систем с перекрывающимися спектрами поглощения компонентов. 3 ил., 2 табл.

1. Способ определения содержания основных производных гемоглобина, основанный на фотометрировании проб крови на нескольких длинах волн видимого диапазона, отличающийся тем, что фотометрирование проводят на m≥n длинах волн в диапазоне 450 - 650 нм, измеряют оптическую плотность раствора крови на выбранных длинах волн и определяют концентрации производных по известным молярным коэффициентам поглощения из системы уравнений вида:

где оптическая плотность раствора крови на i-й длине волны;
миллимолярные показатели поглощения j-й производной гемоглобина на i-й длине волны;
с_j - концентрация j-й производной;
n - число анализируемых производных гемоглобина;
m - число аналитических длин волн;
i - 1, 2...,m. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что определяют четыре производные гемоглобина: оксигемоглобин, дезоксигемоглобин, карбоксигемоглобин, метгемоглобин. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют 1%-ный раствор крови, включающий дистиллированную воду, 0,04%-ный аммиак и буферный раствор. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выбор длин волн осуществляют методами линейного программирования и информационных коэффициентов.