Способ дифференцирования давности образования пятен крови Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 

&д

X)

-ч|

4 Изобретение относится к судебной медицине и может быть использовано в гематологии. Известен способ, в котором при установлении давности образования пятен крови также определяют состояние дериватов гемоглобина путем изучения его спектральных характеристик в. видимой области длин волн tl 1. Недостатком этого способа является низкая чувствительность в определении состояния дериватов гемоглобина пятен крови, что не позволяет его использовать в судебной медицине для установления времени воздействия абиотических факторов окружающей среды на кровяные пятна. Целью изобретения является повыше ние точности способа. Указанная цель достигается тем, что согласно способу дифференцирования давности образования пятен кроBk путем экстрагирования пробы буфернь1м раствором, спектрофотометрирования экстракта в видимом дйапазо не длин волн с добавлением в исследуемую пробу гексациано-( Ш) феррата калия, спектрофотометрирование прово дят в области 575-595 нм,дополнительно снимают спектр поглощения без добавления гексациано-( Ш ) феррата калия, расситьшают разность максимал ных значений оптических плотностей растворов до и после добавления гексациано-(Ш ) феррата калия, далее определяют значения оптической плотности . в изобестической точке в области 585-595 нм и по отношению полученной разности к оптической плотности в изобестической точке дифференцируют давность образования пятен крови. Способ осуществляют следующие образом. Кровь экстрагируют из кровяных пятен в фосфатном буфере Зеренсена рН 7,8, готовят небольшое количество раствора гексациано-(Ш ) феррата калия в фосфатном буфере Зеренсена; осуществляют центрифугирование полученных вытяжек ,из пятен крови; обест печивают одинаковую концентрацию дериватов Нв во всех растворах, осуществляя контроль по значению оптической плотности этих растворов при длине волны, равной 400 нм; проводят спектрофотометрирование всех исследуемых растворов с записью спектров поглощения в области 375-595 нм. Далее в исследуемые растворы добавляют 0,5%-ный раствор гексациано-fffl| феррат калия, обеспечивая полный перевод оксигемоглобина исследуемых растворов в метгемоглобин. Вновь проводят запись спектров поглснцения полученных растворов в области 575595 нм. Затем осуществляют определение значений оптической плотности при длине волны 575-580 нм для вытяжек из кровяных пятен до и после гексациано-{ Ш) феррата калия и нахог дят их разность. Затем определяют значение оптической плотности растворов в изобестичеакой точке при волны 585-595 нм и рассчитывают отношение разности максимумов оптических плотностей при 575-580 нм (до и после добавления гексациано-(ш) феррата калия) к значению оптической плотности в изобестической точке при 585-595 . нм. Полученное при этом значение 5 40 д/Dj jявляется основным критерием, динамика которого свидетельствует о состоянии ;дериватов гемоглобина крови (переход оксигемоглобина в метгемоглобин), обусловленных процессом старения крови in vitro, в частности кровяных пятен, Пример. Для исследования представлены два пятна крови на одинаковом предметоносителе, хранивйих ся неизвестное время в одинаковых условиях воздействия окружающей среды. Необходимо подтвердить или же опровергнуть возможность одновременного образования этих кровяньрс пятен. Для этого нарезают по несколько (например по 5 шт.) кусочков (раз-. мером до 0,5 X 0,5 см) образцов (проб) от обоих кровяных пятен и осуществляют вытяжку (в течение 3040 мин) из всех образцов обоих кровяных пятен в фосфатном буфере Зерен- сена рН 7,8 приготовленного из 1/15 М растворов солей и смешиваемых в определенных пропорциях согласно существующей методике. Готовят небольшое (2-3 мл); количество 0,5%-ного раствора гексагщано-Сш) феррата калия путем растворения (СМ) в фосфатном буфере Зеренсена. Осуществляют центрифугирование полученных вытяжек из пятен крови в течение 10 мин при 5000 об/мин. Используя фосфатный буфер Зеренсена обеспечивают одинаковую концентрацгео дериватов Нв . во всех растворах, осуществляя при этом контроль по значению оптической плотности этих растврров, которая может быть равной 1,75 при Я 400 нм. Далее проводят спектрофотометрирование всех десяти проб. При этом согласно существующей методике осуществляют запись ( например, на СФ - Ю- спектра поглощения в области 575-595 нм первого раствор дериватов Нв, используя при этом плоскопараллельные кюветы с толщиной слоя раствора, равной 10 мм В пробирку наливают 5 .мл исследуемого раствора и добавляют 0,1 мл 0,5%ного расувор (СЫ)3, что обеспе чивает полный перевод (помешивать 20-30 с 1 оксигемоглобина исследуемой пробы в метгемоглобин. Выливают полученный раствор в кювету толщиной 10 мм и производят (согласно методике спектрофотометрического исследования ) запись спектра поглощения по лученного раствора на том же, что и в первом случае, бланке. Извлекают из спектрофотометра бланк с двумя спектрами поглощения. Проводят последовательно спектрофотометрировапие {аналогично описанному) всех оставшихся девяти проб. Далее проводят обработку полученных графических данных. Допустим, что при длине волн, равной 578 нм,оптическая плотность первой пробы раствора дериватов Нв первого пятна крови оказалась равной 0,800 (D, 0,80и ), а после добав ления в этот раствор гексациано-(Ш| феррата калия получили D 0,625. Следовательно, разность максимальньпс значений оптических плотностей прид будет равной 0,175 (дО ,т.е. Л0$1у 0,75. Пусть значение оптической плотности дерива 414 тов Нв в изобестической точке W 592 нмр оказалось равным 0,550, т.е. ,550.Тогда значение S /10578/0 92 для первой пробы первого пятна 5 будет равно 0,318, т.е. ,175/ 0,,318. Если для |последующих; проб первого пятна будут получены значение ,320, ,3IO, fO,315 и S 0,307, то получают значение S 0,,005. Далее, исследуя и обрабатывая статистические данные, полученные по материалам второго кровяного пятна, допустим, получено . ,242 ±0,012. После этого вычисляют критерий значимости t Стьдента по формуле В приведенном примере получают 0,314 - 0,242 0,072 5,54, 1(0,005)+ (0,012) 0,013 Значение t-5,54 (при ) свидетельствует о том, что процесс превращения дериватов гемоглобина крови в. пятнах достоверно (р 0,001) различим. Следовательно, учитывая идентич ность условий хранения и физико-механических свойств предметоносителей, это достоверное различие должно быть связано с различием во. времени хранения,т.е. исследованные пятна крови образованы в различное время. Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить точность определения состояния дериватов гемоглобина крови и дает возможность более достоверно исследовать процесс старения крови, например при решении практических задач судебной медицины.

СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИРОВАНИЯ ДАВНОСТИ ОБРАЗОВАНИЯ ПЯТЕН КРОВИ . / путем экстрагирования пробы буферньм раствором, спектрофотометрирования экстракта в видимом диапазоне длин волн с добавлением в исследуемую пробу гексациано-( Ш ) феррата калия, отличающийся тем,что, с целью повышения точности способа, спектрофотометрирование проводят в области 575-595 нм, дополнительно /снимают спектр поглощения без добавления гексациано-(Ш| феррата калия, рассчитьгаают разность максимальных зна чений оптических плотностей растворов до и после добавления гексациано-(Ш феррата калия, далее определяют значения оптической плотности в изобестической точке в области 585595 нм и по отношению полученной разности к оптической плотности в изобестической точке дифференцируют давность образования пятен крови.