СРЕДСТВО, СТИМУЛИРУЮЩЕЕ ПРОЛИФЕРАЦИЮ ФИБРОБЛАСТОВ Российский патент 2003 года по МПК A61K38/08 

Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности и заключается в применении пептида формулы Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu в качестве средства, стимулирующего пролиферацию фибробластов.

Известно вещество, полученное из цельной крови, являющееся производным гликолипидов и стимулирующее регенерацию клеток и тканей (патент СССР 1396958, МКЛ⁴ А 61 К 35/14); средство пептидной природы, выделенное из плаценты и обладающее противовоспалительным и репаративным действием (АС СССР 948001, МКЛ⁴ А 61 К 35/50). Данные препараты обладают репаративным действием. Известны пептиды с молекулярной массой 8-10 кД, выделенные из гипофизов крупного рогатого скота и стимулирующие пролиферацию фибробластов (Biochim. et Biophys. Acta (P), 626 (1980), 397-411, L.Kelly, D.Puett Preparation). Использование данного препарата в качестве лекарственного средства затруднено в связи со сложностью способа получения, малым выходом активного вещества, значительной вариабельностью физико-химических свойств пептидов, входящих в его состав, а также из-за наличия нежелательных побочных эффектов, ввиду присутствия балластных высокомолекулярных компонентов.

Известны монокины - полипептидные молекулы, продуцируемые клетками макрофагально-моноцитарного ряда и относящиеся к классу цитокинов, которые обладают широким спектром биологической активности, в том числе способны стимулировать пролиферацию фибробластов. К ним относятся гепаринсвязанный эпидермальный ростовой фактор (HB-ECF), вырабатываемый макрофагами и стимулирующий пролиферацию гладкомышечных клеток и фибробластов; трансформирующий фактор роста, вырабатываемый клетками мозга, макрофагами, кератиноцитами и стимулирующий пролиферацию фибробластов, а также индуцирующий развитие эпителия и ангиогенез; тромбоцитарный фактор роста, стимулирующий пролиферацию фибробластов, глиальных клеток, гладкомышечных клеток, клеток эпителия и эндотелия (Жибурт Е.Б., Серебряная Н.Б., Каткова И.В. и др. Цитокины в кроветворении, иммуногенезе и воспалении // Терра Медика Нова.-1996.- 3(4). - С. 15-20; Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции реакции воспаления и иммунитета // Иммунология. - 1995. - 3. - С. 30-44). Известен фактор роста фибробластов (FGF), представляющий собой полипептид с молекулярной массой 50 кДа и длиной цепи 267 аминокислот; его аналоги (патент РФ 97105853, МПК⁶ С 61 К 38/18, 1999); пептиды, которые на 60% идентичны FGF от аминокислотного остатка 28 (Glu) до аминокислотного остатка 207 (Ala) (патент РФ 99109987, МПК⁷ А 61 К 38/16, 2001), а также основной фактор роста фибробластов (bFGF), являющийся частью молекулы природного фактора роста фибробластов с 10 по 155 аминокислоту (патент РФ 2093519, МПК⁶ С 07 К 1/12, 1997). Указанные средства способны стимулировать пролиферацию фибробластов. Однако использование их в качестве лекарственных препаратов затруднено в связи со сложностью и дороговизной промышленного синтеза, возможностью развития аллергических реакций, обусловленной высокой молекулярной массой препарата. Предпочтительнее использовать низкомолекулярные синтетические пептиды. Они эффективны в чрезвычайно малых дозах и не оказывают вредного воздействия на организм.

Известны пародонтальные пептиды, обладающие способностью стимулировать пролиферацию фибробластов [1]. Данное средство по технической сущности и достигаемому эффекту является наиболее близким к предлагаемому решению и является его прототипом. Согласно прототипу пародонтальные пептиды дозозависимо и избирательно стимулируют пролиферацию фибробластов. Этот эффект проявляется в увеличении количества клеток и индекса пролиферации. Одновременно, под влиянием пародонтальных пептидов повышается содержание ДНК и РНК в культуре фибробластов, что также свидетельствует о более интенсивной клеточной пролиферации. Пародонтальные пептиды активны в диапазоне концентраций от 0,5 до 50 мкг/мл. Причем, прослеживается доза-эффект - при увеличении концентрации пародонтальных пептидов в культуральной среде возрастает их специфическая активность. Однако данный пептид обладает низкой биологической активностью. Так, максимальная активность вещества в культуре фибробластов проявляется в концентрации 50 мкг/мл. Это требует применения больших доз препарата и влечет возможное появление аллергических и других нежелательных побочных эффектов.

Настоящее изобретение направлено на расширение арсенала и повышение биологической активности средств, стимулирующих пролиферацию фибробластов.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в качестве средства, обладающего способностью стимулировать пролиферацию фибробластов, предлагается использовать синтетический пептид структурной формулы: Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu. Пептид Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu был известен ранее как средство, обладающее способностью стимулировать дифференцировку Т-лимфоцитов [2, 3]. Пептид синтезировали стандартной методикой твердофазного синтеза путем наращивания пептидной цепи с N-конца [4].

При экспериментальном изучении специфической активности заявляемого средства, проведенном в сравнении с прототипом, выявлена новая, ранее неизвестная для пептида Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu способность стимулировать пролиферацию фибробластов. Это подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Влияние пептида Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu на пролиферацию фибробластов в культуре клеток
Биологическую активность предлагаемого средства изучали по его действию на культуру фибробластов. Фибробласты выделяли по стандартной методике из 8-12 недельных эмбрионов человека, взятых при искусственном прерывании беременности [5], и вносили в среду 199, содержащую гидролизат лактальбумина и 20% фетальной сыворотки теленка в соотношении 1:1. Концентрацию клеток доводили до 3•10⁵/мл. В культуру фибробластов вносили пептид Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu в концентрациях от 0,005 до 0,5 мкг/мл. В качестве контроля в культуру фибробластов добавляли среду 199 в том же объеме, а также пародонтальные пептиды в диапазоне концентраций от 50 до 0,05 мкг/мл. Клетки культивировали в течение 72 часов при 37^oС.

Установлено, что предлагаемое средство оказывает стимулирующее влияние на пролиферацию фибробластов в культуре. Так, при микроскопической оценке, под влиянием пептида Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu возрастает число фибробластов, причем отмечен доза-эффект (таблица 1). Пептид Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu стимулирует пролиферацию фибробластов в диапазоне концентраций от 0,01 до 0,5 мкг/мл. Пародонтальные пептиды (прототип) обладают подобным действием, однако, они эффективны в концентрациях от 0,5 до 50 мкг/мл. Таким образом, минимальная концентрация, в которой заявляемое средство способствует усилению пролиферации фибробластов в культуре клеток, в 50 раз меньше, чем у пародонтальных пептидов, что указывает на более высокую специфическую активность пептида Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu.

Пример 2. Влияние пептида Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu на содержание ДНК и РНК в культуре фибробластов
Уровень ДНК и РНК в культуре фибробластов свидетельствует об интенсивности клеточной пролиферации и является дополнительным подтверждением специфической активности заявляемого средства. Содержание ДНК и РНК в культуре фибробластов определяли по стандартной методике М.Г.Трудолюбивой [6].

Под влиянием пептида Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu в культуре фибробластов возрастает содержание ДНК и РНК, что обусловлено увеличением клеточной массы. Предлагаемое средство проявляет активность в концентрациях от 0,01 до 0,5 мкг/мл. Подобный эффект зарегистрирован у пародонтальных пептидов, но лишь в концентрациях от 0,5 до 50 мкг/мл (таблицы 2, 3). Таким образом, пептид Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu увеличивает уровень нуклеиновых кислот в дозах, 50 раз меньших, чем пародонтальные пептиды, что является отражением его высокой специфической активности.

Результаты экспериментального изучения заявляемого средства свидетельствуют о его высокой биологической активности, превосходящей таковую известного средства - пародонтальных пептидов. По сравнению с прототипом, заявляемый пептид формулы Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu способен стимулировать пролиферацию фибробластов в 50 раз меньших дозах. Уменьшение дозировки заявляемого средства для достижения аналогичного эффекта свидетельствует о более высокой активности предлагаемого средства и дает возможность уменьшить риск побочного влияния.

Таким образом, при экспериментальном изучении специфической активности заявляемого средства установлено, что пептид Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu обладает свойством стимулировать пролиферацию фибробластов.

Предлагаемое средство может найти применение в медицине в качестве стимулятора процессов пролиферации и регенерации при различной патологии, требующей стимуляции регенераторного потенциала.

Источники информации
1. Токарь Д.Л., Степанов А.В., Кузник Б.И., Цыбиков Н.Н., Пинелис И.С., Хавинсон В.Х. Способ получения вещества, стимулирующего пролиферацию фибробластов // АС СССР 1637077, МПК⁶ А 61 К 35/37, заявка 4683547/14 от 25.04.1989.

2. Цепелев С. Л. Биологически активные пептиды бурсы Фабрициуса и их влияние на иммунитет: Дис... канд. мед. наук. - Чита, 2001. - 141с.

3. Цепелев В. Л., Цепелев С.Л., Цыбиков Н.Н., Курупанов С.И. Средство, стимулирующее дифференцировку Т-лимфоцитов // заявка на изобретение 2001103670 от 07.02.2001.

4. Steward J. M. , Young J.D. Solid phase peptide synthesis, San Francisco, 1969.

5. Новые методы культуры животных тканей./ Под ред. Дж. Уосли - М., Мир, 1976.

6. Современные методы в биохимии./ Под ред. В.Н. Ореховича, М., Медицина,1977, с. 313-316.

Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности и заключается в применении пептида формулы Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu в качестве средства, стимулирующего пролиферацию фибробластов. Пептид Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu способен стимулировать пролиферацию фибробластов в 50 раз меньших дозировках, что свидетельствует о его большей специфической активности и дает возможность уменьшить риск побочного влияния. Предлагаемое средство может найти применение в качестве стимулятора процессов пролиферации при различной патологии, требующей активации регенераторного потенциала, и обеспечивает повышение биологической активности. 3 табл.

Применение пептида формулы Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu в качестве средства, стимулирующего пролиферацию фибробластов.