ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS PBCOLE2-ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО КОЛИЦИНА E2, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕТЕРИНАРНОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 2002 года по МПК C12N1/21 A61K35/74 C12N1/21 C12R1/125 

Область использования: микробиология; ветеринарная медицина и биотехнология.

В настоящее время известны продуцируемые E.coli и родственными бактериями антимикробные соединения - колицины, которые обладают активностью против этих бактерий [Плазмиды: методы /Под ред. К.Харди. - М.: Мир, 1990]. Основным недостатком известных колицинов является их низкая антибактериальная активность и отсутствие у них антиоксидантных свойств.

Известен штамм E.coli M17/p Colap, используемый для получения пробиотического препарата (Пат. 2144954, RU). Данный штамм продуцирует колиции, который устойчив к умеренным дозам антибиотиков. В то же время недостатком данного штамма является продукция колицина, имеющего низкую антибактериальную активность и не обладающего антиоксидантными свойствами.

Известен штамм E.coli p.S₅ - мутант универсального индикаторного штамма (заявка 94038721, RU). Данный штамм позволяет выявлять в комплексе с известными индикаторами единичный колицин Е1 и его комбинации. Однако данный штамм предназначен для индикации, и как штамм-продуцент колицина, обладающего антиоксидантным действием, не пригоден.

Задачей изобретения является создание трансформантного штамма Bacillus subtilis, продуцирующего гибридный колицин Е2, который обладает как антибактериальными, так и антиоксидантными свойствами.

Технический результат состоит в конструирования штамма Bacillus subtilis с введенной от E.coli плазмидой рВСо1Е2.

Указанная цель достигается тем, что с помощью генно-инженерных методов конструируют штамм Bacillus subtilis, продуцирующий гибридный колицин Е2, обладающий как антибактериальными, так и антиоксидантными свойствами.

Штамм Bacillus subtilis pBColE2 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Научно-исследовательского института сельского хозяйства Северо-востока России им. Н.В. Рудницкого под регистрационным номером В-771.

Сущность патентуемого генно-инженерного решения поясняется следующей схемой, где на фиг.1 показана схема конструирования гибридной плазмиды pBColE2, а на фиг.2 - получения плазмидного клона в Bacillus subtilis, который содержит участок геномной ДНК Е. соli.

В основе патентуемой конструкции штамма лежат следующие положения.

На первом этапе конструирования штамма Bacillus subtilis на основе плазмид рСо1Е2-Р9 и pBR 322 известными методами (Sihavy T.I, Berman M.L. Experiments with Gene Fusichs, 1984, Corol Spring harbor Laboratory Press, New York, p.78-126) конструируют гибридную плазмиду pBColE2 (фиг.1).

Хозяином исходной плазмиды рСоlЕ2-Р9 является штамм E.coli BZB 2125. При этом для этой плазмиды известны ее нуклеотидная последовательность, функции всех ее генетических элементов, регуляция их активности. Плазмида детерминирует синтез колицина Е2, который губительно действует на клетки родственных бактерий E.coli, расщепляя их ДНК до низкомолекулярных олигонуклеотидов. Плазмида pBR322 является стартовым материалом в конструировании новых векторов, каждый из которых имеет более 10 уникальных рестрикционных сайтов в pBR322.

Рестрикцию сайта PStl, детерминирующего устойчивость к ампициллину, как один из генетических маркеров конструируемого штамма, проводят ферментом EcoR1. Используя эндонуклеазу рестрикции Bsplu11.2, вырезают фрагмент Cna из плазмиды рСо1Е2-Р9, не затрагивая других генетических элементов плазмиды. Затем лигируют фрагмент Cna с фрагментом плазмиды pBR322 Bacillus subtilis, лишенной области Pst I.

В результате получают неконъюгативную и немобилизуемую плазмиду рВСо1Е2, детерминирующую синтез колицина Е2 штаммом Bacillus subtilis.

На втором этапе (фиг.2) осуществляют получение плазмидного клона Bacillus subtilis, который содержит участок геномной ДНК Е. coli K12, соседствующий со вставкой Тn 917. Для этого осуществляют лигирование продуктов расщепления при низкой концентрации ДНК Е. coli для перевода фрагментов в кольцевую форму и дальнейшей трансформации в штамм Bacillus subtilis. При этом фермент рестрикции EcoRI расположен внутри последовательностей плазмиды pBR322, а полученные клоны содержат участки геномной ДНК за пределами ближайшего к вставке Тn 917 сайта узнавания, использованного фермента EcoRI.

При клонировании участков, содержащих вставку Тn 917, которая несет ген erm, используют штамм Bacillus subtilis рВСо1Е2. Рекомбинационную интеграцию последовательностей pBR322 в геномную вставку Тn 917 Bacillus subtilis проводят по методике Youngman P., Zuber P., Perkins J.B. (1985, Science, 228, р. 284-285).

Таким образом, получают штамм Bacillus subtilis рВСо1Е2, продуцирующий гибридный колицин Е2.

Штамм имеет следующие характеристики.

Морфология. Грамположительныe короткие тонкие подвижные палочки 3х5 мкм, споры овальные 0,6•0,9 мкм расположены эксцентрально.

Культурально-физиологические признаки.

На мясопептонном агаре или агаре Хоттингера через 36...40 ч роста при 37^oС - сухие шероховатые мелкоморщинистые бесцветные колонии с матовым или беловатым оттенком.

В мясопептонном бульоне с 5% NaCl или бульоне Хоттингера через 20...24 ч роста при 37^oС - мощная складчатая поверхностная пленка.

Отношение к температуре и рН среды.

Хорошо растет при температуре 35-40^oС и при рН 6,8...7,2 ед.рН.

Биохимические свойства.

Ферментирует (разжижает) желатину, гидролизует крахмал, образует кислоту из глюкозы и сахарозы без газа, не расщепляет тирозин, казеин, арабинозу, ксилозу, маннит. Образует щелочь на цитратно-солевом агаре.

Отношение к антибиотикам.

Устойчив к ампициллину в концентрациях до 120 мкг/мл и тетрациклину - до 170 мкг/мл. Устойчив к бриллиантовой зелени в концентрациях до 70 мг/мл.

Полученный штамм Bacillus subtilis с трансформированной Col-плазмидой при культивировании в жидкой питательной среде, состоящей из триптона, дрожжевого экстракта, глюкозы и калия фосфорнокислого двузамещенного [Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. проф. Д.Г. Звягинцева. - М., изд-во МГУ, 1991] продуцирует гибридные белки, содержащие участки колицинового полипептида. При этом в процессе культивирования гибридные белки высвобождаются в среду, облегчая быструю очистку больших количеств колицина Е2. Выход гибридного колицина Е2 составляет до 10 мг/мл.

Гибридный колицин Е2 обладает одновременно антибактериальным и антиоксидантным действием, поскольку проникает через клеточные мембраны бактерий как матричного штамма Е. coli К12, а также штаммов Pseudomonas, Salmonella, Haemophilus, Pasteurella, Streptococcus и вызывает эндонуклеазную деградацию бактериальной ДНК, то есть не отличается видовой специфичностью, при общей высокой бактерицидности.

Экспериментально установлено, что гибридный колицин Е2 имеет молекулярную массу 78 кДа и отличается от колицина Е2 (97 кДа), продуцируемого штаммами Е.coli (фиг.3). При этом показано, что гибридный колицин Е2 состоит из двух полипептидных субъединиц - собственно бактериоцина с молекулярной массой 68 кДа и белка иммунности с молекулярной массой 10 кДа.

Изобретение иллюстрируется примерами, которые характеризуют гибридный колицин Е2, как обладающий антибактериальными и антиоксидантными свойствами.

Пример 1. При изучении действия гибридного колицияа Е2 на перевиваемые культуры клеток альвеолярных макрофагов получены данные о выработке макрофагами антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы в количестве 1400 ед. через 18 часов после инокуляции гибридного колицина Е2. Это подтверждает, что макрофаги имеют специфические рецепторы клеточной поверхности для связывания гибридного колицииа Е2.

Пример 2. Поскольку при изучении токсичности гибридного колицина Е2 на белых мышах было установлено отсутствие токсинообразования у созданного штамма Bacillus subtilis рВСо1Е2 (LD₅₀=(12768,2±291,6) мг/кг), в ряде хозяйств была проведена практическая апробация ветеринарного препарата на его основе. В частности, при пастереллезе телят в возрасте 2...4 мес. был применен гибридный колицин Е2 в виде инъекционного раствора, в дозе 20 мг на 10 кг веса один раз в сутки, в течение трех дней. Болело 60 животных, наблюдался падеж телят (13 голов). Через 3 дня после лечения колицином в подопытной группе падеж прекратился, а продолжительность течения болезни сократилась с 20 до 3-х дней. В течение двух последующих месяцев случаев заболевания телят в подопытной группе не повторялось. При этом после трех инъекций гибридного колицина Е2 уровень иммуноглобулинов класса G1 в сыворотке крови телят в среднем повысился с (9,0±0,1) до (10,5±0,5) г/л, класса G2 - с (11,6±0,16) до (12,9±0,1) г/л. Количество В-лимфоцитов в крови повысилось с (6,8±0,7) до (10,2+0,6)%(Р<0,05).

Приведенное описание способа конструирования патентуемого штамма достаточно для его повторного получения и промышленного применения.

Изобретение относится к микробиологии, ветеринарной медицине и биотехнологии. Создан трансформаторный штамм Bacillus subtilis, продуцирующий гибридный колицин Е2, обладающий способностью проникать через клеточные мембраны бактерий как матричного штамма Escherichia coli, так и штаммов Pseudomonas, Salmonella, Haemophilus, Ctreptococcus, вызывая эндонуклеазную деградацию бактериальной ДНК. Штамм может быть использован для создания ветеринарного препарата, обладающего антибактериальными и антиоксидантными свойствами. 3 ил.

Штамм бактерий Bacillus subtilis pBcolE2-B771 пpoдyцeнт гибридного колицина Е2, используемый для получения ветеринарного препарата.