ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli M 17/p Colap, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 2000 года по МПК C12N1/21 A61K35/74 

Изобретение относится к биотехнологии и касается создания усовершенствованного штамма Escherichia coli, который может быть использован для получения пробиотиков - бактерийных препаратов на основе живых культур микроорганизмов-симбионтов.

Пробиотики (другие названия препаратов данной группы: нормофлоры, эубиотики, микробиотики) являются эффективным средством для профилактики и лечения дисбактериоза кишечника. Дисбактериоз - это выраженное изменение в видовом и количественном соотношении микробов, которое проявляется в бурном развитии условно-патогенных микроорганизмов, в частности, бактерий семейства кишечной группы (Enterobacteriaceae), и сопровождается различными болезненными проявлениями. Важной причиной дисбактериозов является применение антибиотиков и других противомикробных препаратов [Красноголовец В. Н. "Клиническое значение дисбактериоза кишечника, развившегося в результате применения антибиотиков". В кн. "Применение колибактерина для профилактики и лечения кишечных заболеваний и технология его производства". М., 1967, с. 223 - 243].

В настоящее время в России известны препараты пробиотиков "Колибактерин" и "Бификол", которые получают на основе штамма Escherichia coli М17, который, по-существу, является производным штамма Е.coli, выделенного А. Ниссле и используемого для получения препарата "Mutaflor" (Германия) [Перетц Л.Г. "Сухой колибактерин. Новые методы диагностики, лечения и профилактики кишечных заболеваний". В кн. "Тезисы докладов Пленуму Уч. мед. сов. МЗ РСФСР". М., 1961, с. 52- 54].

Однако, в отличие от исходного штамма, штамм Е. coli М17 утратил способность к синтезу колицина B и, следовательно, снизил свою антагонистическую активность в отношении бактерий кишечной группы [Шемчук Л. Ф. "Стандартизация колибактерина", автореф. канд.б.н., М., 1983, с. 16].

Недостатком штамма E.coli М17 является также чувствительность его к антибиотикам. Поэтому препараты на его основе не могут быть эффективными на фоне приема антибиотиков. Между тем одновременное применение антибиотиков и пробиотиков может предотвращать развитие дисбактериоза и тем самым повышать эффективность терапевтических мероприятий, сокращать сроки лечения.

Задачей изобретения является создание штаммов Е.coli - производного E. coli М17, который позволяет устранить упомянутые выше недостатки известного штамма Е.coli М17, а именно: пониженная антагонистическая активность, чувствительность к антибиотикам.

Технический результат состоит в конструировании штамма с повышенной антагонистической активностью и с резистентностью к умеренным дозам антибиотиков пенициллинового ряда.

Указанная цель достигается тем, что с помощью генетических и генно-инженерных методов конструируют штамм Е.coli М17/pColap, который продуцирует колицин Е1, устойчив к умеренным концентрациям ампициллина (до 150 ЕД/мл).

Штамм Е. coli М17/pColap депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером В-7446.

В основе патентуемой конструкции штамма лежат следующие положения. Нами впервые показано, что введение в штамм Escherichia coli М17 неконьюгативной, немобилизуемой плазмиды pColap, несущей гены продукции колицина Е1 и детерминант устойчивости к ампициллину в дозах до 150 мг/л позволяет создать пробиотический препарат с повышенной антагонистической активностью и резидентный на фоне антибиотикотерапии.

Сущность патентуемого генно-инженерного решения поясняется схемой, где:
на фиг. 1 показана схема конструирования гибридной плазмиды pColap;
на фиг. 2 показаны результаты исследования стабильности сконструированного штамма Escherichia coli М17/pColap.

Для повышения антагонистической активности штамма Е.coli М17 и придания ему устойчивости к ампициллину на основе плазмиды ColE1 известными методами ["Методы молекулярной генетики и генной инженерии", 1990, Новосибирск, "Наука", Сибирское отделение, с. 7-10, 39-44] была сконструирована гибридная плазмида pColap (фиг. 1). Исходная плазмида ColE1, выделенная из непатогенного штамма Е.coli, детально изучена. Она имеет довольно узкий круг хозяев (в основном - штаммы кишечной палочки) и стабильно поддерживается в бактериальных клетках. Известны ее полная нуклеотидная последовательность, функции всех ее генетических элементов, регуляция их активности. Плазмида детерминирует синтез колицина Е1, который губительно действует на клетки родственных бактерий. Недостатком плазмиды ColE1 является ее способность к мобилизации в другие клетки с помощью конъюгативных плазмид, которая обусловлена присутствием в ее структуре mob-области. Используя эндонуклеазу рестрикции BspLu11.1 эту область полностью удалили и при этом практически не затронули другие генетические элементы плазмиды. Затем, используя эндонуклеазу рестрикции BspH1, из известного вектора pUC19 вырезали фрагмент, содержащий ген b1a, кодирующий синтез β-лактамазы, и лигировали его с фрагментом плазмиды ColE1, лишенным mob-области. В результате получили плазмиду pColap. Эта плазмида неконъюгативна и немобилизуема и, следовательно, практически не может быть передана в клетки других бактерий. В отличие от вектора pUC19 и других плазмид, pColap обеспечивает только умеренный уровень устойчивости к ампициллину трансформированным ею штаммам Е.coli (табл. 1). Такое ухудшение экспрессии гена β-лактамазы наблюдается из-за нарушений в промоторной области гена (боксе Гильберта) и 5' - участке, повышающем эффективность экспрессии [Ohyama Т., М. Nagumo, Y. Hirota, S. Sakuma. "Alteration of the curved helical structure located in the upstream region of the в-lactamase promoter of plasmid pUC19 and its effect on the transcription". Nucleic Acids Res. Vol. 20, N 7, 1617 - 1622], произошедших в результате генетических манипуляций в процессе конструирования рекомбинантной плазмиды pColap.

Чувствительность штаммов, несущих pColap, к повышенным концентрациям антибиотика следует считать благоприятным фактором. Так, если по каким-либо причинам присутствие штаммов, содержащих эту плазмиду, в кишечнике пациента становится нежелательным, или если в результате какого-либо исключительного события плазмида переносится в другой штамм, то все клетки, содержащие ее, можно элиминировать из организма, применив высокие концентрации β-лактамных антибиотиков. Плазмидой pColap трансформировали штамм Е.coli М17 и получили штамм Е.coli М17/pColap.

Штамм имеет следующие характеристики.

Морфология. Грамотрицательные слабоподвижные тонкие палочки с закругленными концами 1,5 - 2 мкм в длину.

Культурально-физиологические признаки.

Мясо-пептонный агар и агаризованный бульон Хотингера.

Через 36 ч роста при 37^oC образует круглые беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5 - 2,5 мм, поверхность колоний - гладкая, края - ровные, структура - однородная, консистенция - пастообразная, легко эмульгируются.

Агаризованная минимальная среда М9 с глюкозой (0,2%).

Через 40 ч роста образует колонии 1-2 мм в диаметре, серовато-беловатые, полупрозрачные, круглые, выпуклые, с ровными краями.

Мясо-пептонный бульон и бульон Хотингера.

Через 18-24 ч роста при 37^oC наблюдается сильное равномерное помутнение, небольшой осадок, характерный запах.

Жидкая минимальная среда М9 с глюкозой (0,2 %).

Через 20-24 ч роста с аэрацией наблюдается сильное равномерное помутнение, запах - слабый или отсутствует.

Рост по уколу в мясо-пептонном агаре.

Хороший рост по всему уколу. Микроорганизм является факультативным анаэробом.

Отношение к температуре и pH среды.

Хорошо растет при температуре от 30 до 42^oC и при pH 6,8 - 7,2.

Биохимические свойства.

Хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, лактозу, фруктозу, маннозу, ксилозу, маннит и сорбит с образованием кислоты и газа. Рамнозу, галактозу и арабинозу - со слабым кислотообразованием; салицин - с замедленным кислото- и газообразованием; рафинозу - только с кислотообразованием. Инозит не усваивает. Сероводород не образует; индол вырабатывает.

Отношение к антибиотикам.

Устойчив к ампициллину при концентрациях в среде до 150 мг/л.

Продукция бактериоцинов.

Продуцирует колицин Е1.

Содержание плазмид.

Клетки содержат многокопийную неконъюгативную и немобилизуемую плазмиду pColap (5239 п.н.), детерминирующую устойчивость к ампициллину и синтез колицина Е1.

Штамм имеет антигенную формулу 02:Ll:H6 и агглютинируется сывороткой при титре сыворотки не ниже 1:64000.

Изобретение иллюстрируется примерами, которые характеризуют устойчивость штаммов, несущих различные плазмиды, к ампициллину, стабильность их признаков в процессе культивирования.

Пример 1. Изучение роста штамма Е. coli М17 и его производных, содержащих плазмиды, на средах с разными концентрациями ампициллина.

Исследуемые штаммы кишечной палочки (таблица 1) выращивались в течение 18 ч в бульоне Луриа (LB - 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl на 1 л дистиллированной воды) при 37^oC аэрацией. Затем готовили последовательные разведения бактериальных культур до 10^-7 в физиологическом растворе и высевали каждую культуру на чашки с LA (LB + 1,6% агар), содержащие ампициллин в следующих концентрациях (мкг/мл): 5, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250. Оценку роста колоний производили через 18-24 ч. Результаты представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, исходный штамм кишечной палочки М17 проявляет высокую чувствительность к ампициллину. Плазмида pUC19, содержащаяся в штамме М17/pUC19, которая явилась источником гена β-лактамазы для сконструированной нами плазмиды pColap, придает бактериальной клетке устойчивость к концентрациям ампициллина до 2 г/л. В то же время плазмида pColap, содержащаяся в штамме М17/pColap, обеспечивает устойчивость к концентрациям ампициллина не выше 150 мг/л. Таким образом, полученные штаммы обладают умеренным уровнем устойчивости к ампициллину.

Пример 2. Исследование стабильности признаков штамма Escherichia coli М17/pColap, детерминируемых плазмидой pColap.

Сконструированная нами плазмида pColap обеспечивает продукцию колицина Е1 и устойчивость к ампициллину. Сохранение этих признаков зависит от стабильности поддержания плазмиды в клетках бактерий: утрата плазмиды сопровождается утратой соответствующих признаков.

Определяли стабильность сохранения устойчивости к ампициллину и колициногенности полученных штаммов при культивировании их в жидкой питательной среде в отсутствие селективного агента на протяжении 100 генераций. В качестве положительного контроля использовали исходную плазмиду ColEI, а отрицательного - плазмиду pBR322, производную ColEI, не содержащую локуса cer, который влияет на стабильность плазмид.

Культуры штаммов М17/pColap, М17/ColЕ1 и M17/pBR322 выращивались в течение 18 ч с усиленной аэрацией при 37^oC в LB с ампициллином (100 мкг/мл). Штамм М17/ColЕ1 выращивали в тех же условиях, но без ампициллина. Полученные культуры содержали примерно 10⁹ бактериальных клеток в 1 мл. Затем в пробирки с 10 мл LB (без добавленного антибиотика) вносили 10 мкл (10⁶) соответствующей бактериальной культуры. Полученную суспензию выращивали как описано выше. При таком культивировании бактериальные клетки успевали пройти 10 делений. Повторив эту операцию 10 раз, мы получили бактериальную культуру, прошедшую 100 генераций с момента первого засева в среду без селективного агента.

Перед каждым засевом отбирались пробы бактериальной культуры и проверялись на наличие свойств устойчивости к ампициллину и продукции колицина. Для этого суспензии клеток рассевались на чашках с LA до получения отдельных колоний. Затем по 100 колоний каждого штамма проверялись на способность к росту на той же среде в присутствии ампициллина (100 мкг/мл). Кроме того, колонии проверялись на способность продуцировать колицин Е1. Для этого использовался тест с нанесением верхнего агара (Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976, с. 183-189). Тест заключается в следующем: на чашки с твердой питательной средой, содержащей 1,6% агар, репликатором или зубочисткой перекалывают исследуемые колонии. Чашки инкубируют при 37^oC в течение 3 - 4 час, индуцируют продукцию колицина облучением ультрафиолетом в течение 4-5 сек и инкубируют в тех же условиях в течение ночи. Затем клетки лизируют парами хлороформа при комнатной температуре в течение 30 - 40 мин. Важно проследить, чтобы на следующем этапе весь хлороформ выветрился из чашки. Наслаивают на нижний слой агара 3-5 мл полужидкого (0,7%) агара, содержащего 10⁷/мл бактериальных клеток тест-штамма Е. coli (чувствительного к колицину Е1). Инкубируют ночь при 37^oC. Регистрируют наличие зон просветления в слое тест-культуры вокруг пятен исследуемых штаммов.

Результаты исследования стабильности сконструированного штамма Escherichia coli М17/pColap приведены на фиг. 2 (ColE1 соответствует штамму М17/ColЕ1, pBR322 - штамму M17/pBR322, pColap - штамму М17/pColap). Присутствие плазмиды в бактериальной клетке следует из сохранения ею исходных свойств (колициногенности и/или устойчивости к ампициллину).

Результаты эксперимента (фиг. 2) свидетельствуют, что лишенная cer локуса плазмида pBR322 быстро элиминируется из бактериальной популяции при выращивании в среде, лишенной антибиотика, в то время как две другие плазмиды (исходная ColE1 и рекомбинантная pColap) стабильно наследуются клетками в этих условиях.

Это свойство является одним из важным преимуществ нашей конструкции, поскольку, с одной стороны, облегчает получение стандартного препарата на основе штамма, содержащего pColap, а с другой стороны гарантирует, что при приеме препарата пациентом без сопутствующей антибиотикотерапии не произойдет элиминация плазмиды.

Промышленная применимость. Приведенное описание способа конструирования патентуемого штамма Escherichia coli М17/pColap достаточно для повторного получения штамма с использованием стандартных методик, реагентов и оборудования, применяемых в генно-инженерных исследованиях.

Изобретение относится к биотехнологии, касается получения продуктов для пробиотических препаратов - бактерийных препаратов на основе живых культур микроорганизмов - симбионтов, используемых для профилактики и лечения дисбактериозов и других расстройств желудочно-кишечного тракта. В штамм Escherichia coli М17 - продуцент для пробиотического препарата колибактерин -была введена неконъюгативная, немобилизуемая плазмида рСоlар, несущая гены продукции колицина Е1 и детерминант устойчивости к ампициллину в дозах до 150 мг/л. Это позволяет создать пробиотический препарат с повышенной антагонистической активностью и резидентный на фоне антибиотикотерапии. Это облегчает получение стандартного препарата на основе штамма и гарантирует, что при приеме препарата пациентом без сопутствующей антибиотикотерапии не произойдет элиминация плазмиды. 1 табл., 2 ил.

Штамм бактерий Escherichia coli M 17/p Colap ВКПМ В-7446, используемый для получения пробиотического препарата.