СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ХИТОЗАНА ДЛЯ ПРОТИВОЛУЧЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2002 года по МПК C08B37/08 C12P19/04 A61K31/722 

Описание патента на изобретение RU2188829C1

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано для создания на основе природных полисахаридов новых радиопротекторов.

Известен способ получения низкомолекулярного хитозана кислотным гидролизом хитозана с помощью азотистой кислоты [1]. Однако в этом случае трудно получить продукт со средневязкостной молекулярной массой ниже 20000 Да, к тому же происходит химическое дезаминирование концевого остатка сахара с изменением строения полисахарида.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана ферментативным гидролизом хитозана с помощью иммобилизованного хитиназного комплекса [2]. Главным достоинством этого способа является возможность получения с высоким выходом низкомолекулярного водорастворимого хитозана с высокой степенью чистоты. Однако процесс проводится в две стадии, сначала при рН 4,5-5,0, а потом при рН 6,0-6,5. Суммарное время проведения процесса составляет от 24 до 28 часов, и при этом получается хитозан с широким разбросом по средневязкостной молекулярной массе от 5 до 20 кДа.

С целью преодоления указанных недостатков предлагается упрощенный способ получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана ферментативным гидролизом раствора хитозана с последующим выделением фракции, характеризующейся радиопротекторными свойствами.

Выбор оптимальной средневязкостной молекулярной массы низкомолекулярного хитозана, получаемого предложенным способом, был осуществлен на основе сравнительной оценки показателей острой токсичности и противолучевой эффективности хитозанов с ММ 30, 10 и 5 кДа. Острую токсичность образцов хитозана определяли по показателю летальности в опытах на нелинейных мышах-альбиносах. Наблюдение за животными проводили в течение 5 суток после внутривенного введения образцов в разных дозах. Результаты обработаны пробит-методом и установлены значения полулетальных доз (СД 50), а также СД 84 и СД 16. Результаты, приведенные в таблице, свидетельствуют о том, что по мере уменьшения молекулярной массы хитозана уменьшается и его токсичность.

Противолучевая (защитная) эффективность хитозана исследована на нелинейных белых мышах и гибридах F1(CBA•C57B1). Образцы с ММ 30, 10 и 5 кДа вводили внутривенно перед облучением (за 10-20 минут). Мышей облучали гамма-лучами Cs137 в дозах 8,0 и 8,25 Гр с мощностью 1,25 Гр/мин. Установлено, что хитозан с ММ 30 и 10 кДа, вводимый соответственно в дозе 20 и 50 мг/кг, способствует выживаемости 89-100% животных при почти полной гибели контрольных. Увеличение или уменьшение доз этих образцов приводит к уменьшению или отсутствию защитного действия. При использовании хитозана с ММ 5 кДа защитное действие либо заметно уменьшается, либо не проявляется совсем.

Таким образом, по совокупности свойств, т.е. проявлению наименьшей токсичности при максимальной противолучевой защите, оптимальными оказались образцы хитозана с ММ 10±2 кДа.

Сущность предложенного способа заключается в том, что 1-2% раствор хитозана при рН 4,5-5,5 инкубировали при 40-50oС в присутствии комплекса хитинолитических ферментов в течение 20-60 минут. Затем реакционную массу выдерживали 3-7 минут на кипящей водяной бане, охлаждали, фильтровали и фракционировали либо с помощью хроматографии, либо с помощью мембранных технологий, выделяя при этом фракцию с ММ от 8 до 12 кДа. Продукт диализовали против воды и высушивали. Полученное вещество водорастворимо (до 50 мг в 1 мл) и легко стерилизуется кипячением, нетоксично.

Пример 1.

Растворяют 1 г крабового хитозана со степенью деацетилирования (СД) 85% и молекулярной массой около 400 кДа в 100 мл 0,2 М ацетата натрия при рН 5,0. Раствор нагревают до 45oС, добавляют фильтрат культуральной жидкости Streptomyces kurssanovii (1 единицу активности) и инкубируют 30 минут при той же температуре. Затем гидролизат выдерживают 5 минут на кипящей водяной бане, охлаждают, концентрируют на роторном испарителе, фильтруют и наносят на хроматографическую колонку с сорбентом Био-Гель П-4, уравновешенную 0,1 М ацетатом натрия при рН 6,0. Проводят элюцию тем же раствором, выделяя фракции с ММ 8-12 кДа, которые объединяют, диализуют против воды и лиофильно высушивают.

Получают 0,7 г низкомолекулярного хитозана в виде белого порошка, растворимого в воде.

Эффективность низкомолекулярною хитозана с ММ 8-12 кДа устанавливалась в опытах на облученных мышах. Хитозан вводили мышам F1(CBA•C57B1) внутривенно в дозе 50 мг/кг за 10-30 мин до облучения в дозе 8,25 Гр: из 7 защищенных мышей через 30 суток после облучения выжило 7 при гибели всех контрольных животных.

Пример 2.

Растворяют 1 г хитозана антарктической креветки (криля) со СД 90% и молекулярной массой 150 кДа в 100 мл 0,1 М ацетата натрия при рН 5,5. Раствор нагревают до 50oС, добавляют фильтрат культуральной жидкости (0,5 единиц активности) и инкубируют 60 минут при той же температуре. Затем гидролизат выдерживают 3 минуты на кипящей водяной бане, охлаждают, концентрируют методом ультрафильтрации до объема 10 мл, фильтруют и наносят на колонку с сорбентом Сефадекс Г-25, уравновешенную 0,15 М ацетатом натрия при рН 5,0. Проводят элюцию тем же раствором, выделяя фракции с молекулярной массой 8-12 кДа, которые объединяют, диализуют против воды и высушивают на распылительной сушилке. Получают 0,6 г низкомолекулярного хитозана в виде белого водорастворимого порошка.

Изучение эффективности проведено аналогично примеру 1 на нелинейных мышах альбиносах, облученных в дозе 8,0 Гр: к концу срока наблюдения (30 суток) из 11 защищенных хитозаном мышей выжило 10, в контроле из десяти - одна.

Пример 3.

Растворяют 1 г хитозана креветки со СД 75% и ММ 250 кДа в 100 мл 0,3 М ацетата натрия при рН 4,5. Раствор нагревают до температуры 40oС, добавляют фильтрат культуральной жидкости Streptomyces kurssanovii (2 единицы активности) и инкубируют 45 минут при той же температуре. Затем гидролизат выдерживают 7 минут на кипящей бане, охлаждают, концентрируют на роторном испарителе до объема 10 мл, фильтруют и наносят на хроматографическую колонку с сорбентом Фрактогель HW-50, уравновешенную 0,05 М ацетатом натрия при рН 5,5. Проводят элюцию тем же раствором, выделяя фракции с ММ 8-12 кДа, которые объединяют, диализуют против воды и лиофильно высушивают.

Получают 0,5 г низкомолекулярного хитозана в виде белого порошка, растворимого в воде.

Эффективность полученного хитозана изучена аналогично примеру 2. Введение хитозана до облучения способствовало выживанию 8 мышей из 10, при этом в контроле пали все 10 мышей.

Пример 4
Аналогично примеру 1, однако берут хитозан со СД 95% и ММ 200 кДа.

Получают 0,6 г низкомолекулярного хитозана.

Пример 5
Аналогично примеру 1, однако берут фермент в количестве 0,5 единиц и время гидролиза составляет 50 минут.

Получают 0,7 г низкомолекулярного хитозана.

Пример 6
Аналогично примеру 1, только хитозан растворяют при рН 4,5, при этом же значении и проводят гидролиз в течение 40 минут.

Получают 0,6 г низкомолекулярного хитозана.

Пример 7
Аналогично примеру 1, только хитозан берут со СД 70% и процесс гидролиза проводят 45 минут.

Получают 0,5 г низкомолекулярного хитозана.

Противолучевая активность образцов, полученных в примерах 4-7, изучена в четырех последовательных сериях экспериментов на нелинейных мышах аналогично примеру 2. Выживаемость животных, защищенных хитозаном, составила 87%, 75%, 80% и 90% при практически полной гибели в контроле.

Предложенный способ экологически безопасен, менее трудоемок по сравнению с известными способами и позволяет получать продукт высокого качества с выходом 50-70%.

Источники информации
1. Allan G.C., Ryan C.A.// Carbohydr. Res. 1995. V.277. N 2. Р.257-272.

2. Варламов В.П., Стояченко И.А., Буданов М.В. Способ получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана. Патент РФ N 2073016, Бюлл. 4, 1997.

Похожие патенты RU2188829C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ХИТОЗАНА В БЕССОЛЕВОЙ СРЕДЕ ПУТЕМ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ ДЕПОЛИМЕРИЗАЦИИ 2009
  • Куликов Сергей Николаевич
  • Тюрин Юрий Александрович
  • Фассахов Рустэм Салахович
  • Ильина Алла Викторовна
  • Варламов Валерий Петрович
  • Албулов Алексей Иванович
RU2425844C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ФОРМ ХИТОЗАНА 2001
  • Комаров Б.А.
  • Албулов А.И.
RU2215749C2
СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ КОМПЛЕКСОВ МЕЖДУ ГЕПАРИНАМИ И ПОЛИКАТИОНАМИ 2006
  • Дрозд Наталья Николаевна
  • Толстенков Александр Сергеевич
  • Макаров Владимир Александрович
  • Банникова Галина Евгеньевна
  • Варламов Валерий Петрович
  • Скрябин Константин Георгиевич
RU2370271C2
СРЕДСТВО ЛЕЧЕНИЯ ОСТРЫХ РАДИАЦИОННЫХ ПОРАЖЕНИЙ 2004
  • Ильин Л.А.
  • Михайлов П.П.
  • Шлякова Т.Г.
RU2260425C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЛИГОМЕРОВ ХИТОЗАНА 2011
  • Манаенков Олег Викторович
  • Каменщиков Алексей Андреевич
  • Кислица Ольга Витальевна
  • Степаненко Юлия Викторовна
  • Сульман Михаил Геннадьевич
RU2445101C1
ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ХИТИНОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И ЛАМИНАРИНАЗЫ 2001
  • Мелентьев А.И.
  • Актуганов Г.Э.
  • Усанов Н.Г.
  • Кузьмина Л.Ю.
RU2213773C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЛИГОМЕРОВ ХИТОЗАНА 2006
  • Фролов Вадим Геннадиевич
  • Шеремет Игорь Михайлович
  • Темников Александр Владимирович
  • Лунин Евгений Михайлович
  • Нистратов Вячеслав Петрович
RU2316592C1
Способ получения низкомолекулярного хитозана и олигомеров хитозана 2016
  • Шагдарова Бальжима Цырендоржиевна
  • Лопатин Сергей Александрович
  • Коновалова Мария Владимировна
  • Ильина Алла Викторовна
  • Албулов Алексей Иванович
  • Варламов Валерий Петрович
RU2627870C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА С ПОМОЩЬЮ МОДИФИЦИРОВАННОГО ХИТОЗАНА 2019
  • Луньков Алексей Павлович
  • Ильина Алла Викторовна
  • Шагдарова Бальжима Цырендоржиевна
  • Варламов Валерий Петрович
RU2701914C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ХИТОЗАНА 2010
  • Купреев Николай Иосифович
  • Быковский Дмитрий Владимирович
  • Кузнецов Вячеслав Алексеевич
  • Ваел Шехта Матвалли Эльсайед Елазаб
RU2417088C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 188 829 C1

Реферат патента 2002 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ХИТОЗАНА ДЛЯ ПРОТИВОЛУЧЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ

Описывается способ получения низкомолекулярного хитозана. Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано для создания на основе природных полисахаридов новых радиопротекторов. Сущность предложенного способа заключается в том, что ферментативное расщепление раствора хитозана проводят растворимым комплексом микробных хитинолитических ферментов при рН 4,5-5,5 температуре 40-50oС в течение 30-60 мин при соотношении хитиназная активность-хитозан от 0,5 до 2,0 ед. активности на 1 г хитозана, затем реакционную массу выдерживают 3-7 мин на кипящей водяной бане, охлаждают, концентрируют, фильтруют, фракционируют, выделяя фракцию со средневязкостной молекулярной массой от 8 до 12 кДа, полученный раствор диализуют против воды, продукт сушат. Полученное вещество водорастворимо (до 50 мг в 1 мл) и легко стерилизуется кипячением, нетоксично. Выживаемость животных, защищенных полученным хитозаном, составляет 75-90% при практически полной гибели в контроле, после облучения дозой 8,0 Гр. 1 табл.

Формула изобретения RU 2 188 829 C1

Способ получения низкомолекулярного хитозана для противолучевых препаратов ферментативным расщеплением раствора хитозана, отличающийся тем, что ферментативное расщепление проводят растворимым комплексом микробных хитинолитических ферментов при рН 4,5-5,5, температуре 40-50oС в течение 30-60 мин при соотношении хитиназная активность-хитозан от 0,5 до 2,0 ед. активности на 1 г хитозана, затем реакционную массу выдерживают 3-7 мин на кипящей водяной бане, охлаждают, концентрируют, фильтруют, фракционируют и полученный раствор диализуют против воды.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2002 года RU2188829C1

RU 2073016, 10.02.1997
Способ получения водорастворимых олигосахаридов 1988
  • Максимов Вячеслав Иванович
  • Денисов Виктор Михайлович
  • Макаров Николай Васильевич
SU1571047A1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХИТОЗАНА 1989
  • Ениколопов Н.С.
  • Гальбрайх Л.С.
  • Роговина С.З.
  • Вихорева Г.А.
  • Акопова Т.А.
  • Сахоненко Л.С.
  • Зеленецкий С.Н.
SU1760749A1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКТОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА 1992
  • Величко Б.А.
  • Абрамова Г.В.
  • Шутова Л.А.
  • Когтев Л.С.
  • Волохова М.В.
RU2027758C1

RU 2 188 829 C1

Авторы

Варламов В.П.

Ильина А.В.

Банникова Г.Е.

Немцев С.В.

Ильин Л.А.

Чертков К.С.

Андрианова И.Е.

Платонов Ю.В.

Скрябин К.Г.

Даты

2002-09-10Публикация

2000-12-18Подача