СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКТОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА Российский патент 1995 года по МПК C12N9/14 C08B37/08 C12P7/64 C12N1/14 

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к способу получения продуктов микробиологического синтеза, и может быть использовано в микробиологической промышленности при получении пектолитических, целлюлолитических ферментов, липидов и хитинсодержащего комплекса.

Известен способ получения посевного материала для получения ферментных препаратов мицелиальных грибов роста Aspergillus, состоящий в том, что проводят посев мицелия продуцента на твердую питательную среду с последующим активированием культуры облучением светом с λ = =670 нм и мощностью светового потока 3,8-4,6 Вт/м² при 27-33^оС в течение 2-7 сут.

Пектолитическая активность ферментов, получаемая при применении активированного посевного материала, составляет 9,5-9,9 ед/мл.

Известен способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов пектолитических ферментов, предусматривающий получение экстракта свекловичного жома, вытяжки солодовых ростков, автолизата мицелия продуцента с последующим смешиванием этих компонентов с минеральными солями. В среду дополнительно вводят концентрат культуральной жидкости выращиваемого продуцента, полученный после выделения из него ферментов, содержащий 100-160 г/л сухих веществ. Пектолитическая активность культуральной жидкости 92 ед/мл по интерферометрическому методу определения активности, что соответствует 0,3 ед/мл по ГОСТ 20264.3-74.

Известен способ приготовления питательной среды для продуцентов пектолитических ферментов, включающий ферментативный гидролиз экстракта свекловичного жома, добавление пектиназы из расчета 5 ед/мл экстракта, смешивание гидролизата, вытяжку солодовых ростков, автолизат мицелия и минеральных солей [1]. Пектолитическая активность полученной культуральной жидкости составляет 282 ед/мл, что соответствует 0,9 ед/мл по ГОСТ 20264.3-74.

Известен способ получения пектолитических ферментов, включающий посев мицелиальных грибов рода Aspergillus на питательную среду, выращивание культуры в 2 стадии при аэрации, причем на первой стадии аэрацию питательной среды проводят путем пропускания 1-3 м³ воздуха на 1 м³ питательной среды в 1 мин. при 26-38^оС, а на второй стадии 0,2-0,5 м³ воздуха на 1 м³ питательной среды при 22-36^оС, отделение биомассы и выделение пектолитических ферментов [2]. Пектолитическая активность культуральной жидкости составляет 4,8-5,0 ед/мл (ГОСТ 20264.3-74).

Известен способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов целлобиазы, предусматривающий двухстадийный гидролиз целлюлозосодержащего сырья:
на 1-ой стадии гидролиз проводят целлюлазным комплексом, содержащим целлобиогидролазу и эндоглюканазу;
на 2-ой стадии - целлобиазной.

Целлобиазная активность - 24,5 мкмол/мин. мл.

Известен наиболее близкий к заявленному способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов целлобиогидролазы в эндоглюканазы, предусматривающий гидролиз целлюлозосодержащего сырья пектолитическими и целлюлолитическими ферментами [3].

Эндоглюканазная активность 2,2 ед/мл и целлобиогидролазная активность (по гидролизу фильтровальной бумаги) 12,2 мг гл/мл (ед/мл).

Недостатками вышеуказанных способов являются недостаточно высокая ферментативная активность, а также то, что не предусмотрена комплексная утилизация отходов ферментного производства.

Заявляемое изобретение направлено на получение продуктов микробиологического синтеза по замкнутому малоотходному циклу производства и повышение активности ферментов.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе получения продуктов микробиологического синтеза, включающем активацию посевного материала мицелиальных грибов - продуцентов пектолитических или целлюлолитических ферментов, приготовление стерильной питательной среды, гидролиз в присутствии гидролизующего агента, введение минеральных солей и пеногасителя, засев и культивирование продуцента при аэрации стерильным воздухом, фильтрацию культуральной жидкости, отделение биомассы и выделение ферментов, активацию посевного материала проводят облучением монохроматическим светом с длиной волны λ_макс.= 530 нм и мощности светового потока 2,05-3,5 Вт/м², в качестве пеногасителя используют липиды, выделенные из биомассы продуцентов пектолитических или целлюлолитических ферментов в количестве 0,01-0,15 мас. % , в качестве гидролизующего агента используют пермеат, образующийся на стадии ультрафильтрации, взятый в количестве из расчета 20-28 ед. пектолитической активности на 1 г растительных компонентов при приготовлении среды для культивирования продуцентов пектолитических ферментов или 4,7-7,1 ед. целлобиогидролазной активности на 1 г растительных компонентов при приготовлении среды для культивирования продуцентов целлюлолитических ферментов, причем в пермеат предварительно вводят в качестве стабилизаторов ферментов CaCl₂ или MnSO₄ в количестве 0,020-0,025 мас.%, а из биомассы выделяют липиды и хитинсодержащий комплекс.

Выделение липидов проводят экстракцией биомассы полярными и неполярными растворителями или их смесями с последующим концентрированием экстракта.

Выделение хитинсодержащего комплекса проводят после выделения липидов промывкой твердого остатка биомасы водой или растворами неорганических веществ, выбранных из групп кислот, солей, щелочей.

Указанный выше результат достигается только в заявленной совокупности существенных признаков, а именно: получение ферментов с повышенной активностью обеспечивается только при сочетании активации посевного материала монохроматическим светом с длиной волны λ_макс. = 530 нм и мощностью светового потока 2,05-3,50 Вт/м² при наличии в питательной среде липидов и стабилизированного пермеата. Исключение хотя бы одного из вышеуказанных признаков или изменение параметров активации не приводит к повышению активности получаемых ферментов.

Возможность создания замкнутого цикла производства обеспечивается последовательными стадиями технологического процесса:
а) выделение ферментов;
б) выделение липидов;
в) выделение хитинсодержащего комплекса.

Только указанная последовательность обеспечивает максимальный выход целевых продуктов, т.к. при разрыве технологической цепочки происходит резкое снижение выхода продуктов на стадиях б) и в) и делает нецелесообразным выделение липидов и хитинсодержащего комплекса.

П р и м е р 1. Мицелий культуры Trichoderma viride 13/10 (культура хранится в коллекции ВНИИгенетика) выращивают на косяках с суслом-агаром в течение 6 сут при 30^оС до обильного спороношения. Для получения посевного материала среду с суслом-агаром засевают споровой суспензией, смытой с косяков. Выращивание спорового материала проводят при 28^оС в течение 3 сут при постоянном освещении люминесцентными лампами с λ_макс. = 530 нм и мощностью светового потока 2,05 Вт/м².

Активированный светом трехсуточный посевной материал в виде суспензии конидий вносят в колбу со стерильной средой следующего состава, мас.%: свекловичный жом 3; солодовые ростки 1,4; пшеничные отруби 0,5; (NH₄)₂SO₄ 0,2; KH₂PO₄ 0,4; MgSO₄ 0,05. Засеянную среду помещают на качалку. Прокачивание на качалке ведут при t = 28^оС в течение 15 ч.

Питательную среду для ферментации готовят следующим образом.

В 8 л пермеата (целлобиогидролазная активность 0,5 ед/мл из расчета 7,1 ед./г растительного сырья), образующегося на стадии ультрафильтрации глубинной культуры T. viride 13/10, вносят 2 г СаCl₂, затем при перемешивании вносят 250 г свекловичного жома, 250 г гузапаи, 30 г пшеничных отрубей и 40 г солодовых ростков, устанавливают рН 4,5. Полученную смесь выдерживают при 45^оС в течение 1,5 ч. Затем добавляют 10 г липидов, выделенных из биомассы T. viride 13/10, и соли: 40 г однозамещенного фосфорно-кислого калия и 40 г азотно-кислого аммония. Объем среды доводят водой до 10 л. Полученную среду стерилизуют при 121^оС в течение 1 ч, охлаждают до 30^оС и засевают подготовленным активированным посевным материалом Trichoderma viride 13/10.

Культивирование проводят в 15-литровом ферментере в течение 102 ч, причем до 31 ч. поддерживают температуру на уровне 30^оС при аэрации стерильным воздухом 1 м³/м³ ˙мин, а затем температуру снижают до 26^оС, а подачу воздуха до 0,5 м³/м³ ˙мин.

По окончании культивирования глубинную культуру подают на фильтрацию. Целлобиогидролазная активность в фильтрате составляет 15,2 ед/мл, эндоглюконазная активность 2,7 ед/мл. Затем фильтрат культуральной жидкости направляют на ультрафильтрацию. Концентрат сушат и получают ферментный препарат Целловиридин Г20х. Пермеат, образующийся на стадии ультрафильтрации, подают на стадию приготовления питательной среды. Биомассу со стадии фильтрации направляют на выделение липидов и хитинсодержащего комплекса.

Для выделения липидов биомассу экстрагируют смесью растворителей: изопропанол-ортофосфорная кислота при объемном соотношении 95:5 в течение 2 ч при жидкостном модуле (далее модуль) 5:1. Затем суспензию отфильтровывают и жидкую фазу упаривают до полной отгонки растворителей.

Выход липидов 0,25 г из биомассы, полученной из 100 мл глубинной культуры. К_н - степень ненасыщенности по жирно-кислотному составу липидов равна 1,1.

Твердый остаток обрабатывают 1% -ным раствором КОН в изопропаноле в течение 1 ч при модуле 5: 1. Затем смесь фильтруют, твердый остаток, представляющий собой хитинсодержащий комплекс, сушат. Выход 1,2 г из биомассы, полученной из 100 мл глубинной культуры. Содержание глюкозамина 0,82 мг/100 мг комплекса.

Примеры 1-10, иллюстрирующие получение продуктов микробиологического синтеза при культивировании Trichoderma viride 13/10, представлены в табл. 1.

П р и м е р 11. Мицелий культуры Aspergillus foetidus М-45 (культура хранится в коллекции ВНИИгенетики) выращивают на косяках с морковным агаром в течение 6 сут при 30^оС до обильного спороношения. Для получения посевного материала среду с морковным агаром засевают споровой суспензией, смытой с косяков. Выращивание спорового материала проводят при 26^оС в течение 4 сут. при постоянном освещении лампами с λ_макс. = 530 нм и мощностью освещения 3,5 Вт/м².

Активированный светом 4-суточный посевной материал в виде суспензии конидий вносят в колбу со стерильной питательной средой, состоящей из 70% пшеничных отрубей, 1% сульфата аммония и 29% мелко размолотого свекловичного жома, увлажненной водой до 60%. Засеянную среду помещают в термостат, где выдерживают при 30^оС в течение 5 сут. Затем колбы вынимают из термостата и выдерживают при комнатной температуре в течение 5-6 сут.

Перед посевом производственной питательной среды в колбу с посевным материалом вносят 200 мл стерильной водопроводной воды и прокачивают на качалке в течение 10 ч.

Питательную среду для культивирования Aspergillus foetidus М-45 готовят следующим образом.

В 8 л пермеата от производства пектолитических ферментов с остаточной пектолитической активностью 0,7 ед./мл (из расчета 28 ед. на 1 г растительных компонентов) вносят 2,3 г MnSO₄, затем при перемешивании вносят 200 г свекловичного жома. рН смеси устанавливают 4,0. Поднимают температуру до 40^оС. Ферментативный гидролиз ведут в течение 2 ч. По истечении указанного времени в гидролизат добавляют 1 л вытяжки солодовых ростков, 0,4 л автолизата мицелия, 70 г (NH₄)₂SO₄, 10 г КН₂РО₄, 5 г MgSO₄, 15 г липидов, выделенных из биомассы Aspergillus foetidus М-45. Объем доводят водой до 10 л.

Приготовленную таким образом питательную среду стерилизуют, охлаждают до 30^оС и засевают приготовленным выше описанным способом посевным материалом.

Культивирование проводят в 15-литровом ферментере в течение 72 ч, причем до 31-ого ч. поддерживают температуру на уровне 29^оС и аэрацию стерильным воздухом 1 м³/м³ ˙мин, а затем температуру снижают до 26^оС, а подачу воздуха до 0,5 м³/м³ ˙мин.

По окончании культивирования глубинную культуру A. foetidus М-45 подают на фильтрацию. Пектолитическая активность в фильтрате составляет 12 ед./мл.

Фильтрат культуральной жидкости направляют на ультрафильтрацию. Концентрат сушат и получают ферментный препарат Пектофоетидин Г20х, а пермеат идет на стадию приготовления питательной среды для культивирования A. foetidus М-45. Биомассу со стадии фильтрации направляют на выделение липидов и хитинсодержащего комплекса.

Для выделения липидов биомассу экстрагируют смесью растворителей: изопропанол-ортофосфорная кислота при объемном соотношении 95:5 в течение 2 ч при гидромодуле 5:1. Затем суспензию отфильтровывают и жидкую фазу упаривают до полной отгонки растворителей.

Выход липидов из биомассы, полученной из 100 мл глубинной культуры, 0,32 г; К_н 1,15.

Твердый остаток обрабатывают 1%-ным раствором КОН в изопропаноле в течение 1 ч. при гидромодуле 5:1. Затем смесь фильтруют. Твердый остаток, представляющий собой хитинсодержащий комплекс, сушат.

Выход 1,3 г биомассы, полученной из 100 мл глубинной культуры.

Содержание глюкозамина 0,90 мг/100 мг комплекса.

Примеры 11-18, иллюстрирующие возможность получения продуктов микробиологического синтеза при культивировании Aspergillus foetidus М-45, представлены в табл. 2.

П р и м е р 19. Посевной материал готовят по примеру 11, но используют в качестве продуцента целлобиазы мицелиальный гриб Aspergillus awamori F-122.

Питательная среда готовится следующим образом.

В 7 л пермеата от производства целлюлолитических ферментов с остаточной целлобиогидролазной активностью 0,5 ед./мл (из расчета 7 ед. на 1 г растительных компонентов) вносят 2,5 г СаCl₂. Далее при перемешивании вносят 300 г свекловичного жома, 100 г овсяной шелухи, 100 г солодовых ростков, 100 г пшеничных отрубей. Устанавливают температуру 50^оС и рН = 4,5. Выдерживают 1 ч. Затем снижают температуру до 45^оС и добавляют целлобиазу из расчета 10 ед. /г сухих веществ. Смесь выдерживают 1 ч при 45^оС. По окончании гидролиза вносят соли: (NH₄)₂SO₄ 60 г, КН₂РО₄ 20 г, MgSO₄ 6 г и 15 г липидов, выделенных из биомассы A. foetidus М-45. Объем доводят до 10 л водой. Среду стерилизуют, охлаждают до 30^оС и засевают активированным посевным материалом A. awamori F-122.

Культивирование ведут аналогично примеру 11, но время культивирования 96 ч.

Целлобиазная активность в фильтрате глубинной культуры 32,3 ед./мл.

Процесс выделения липидов и хитинсодержащего комплекса аналогичен описанному в примере 11.

Выход липидов из биомассы, полученной из 100 мл глубинной культуры 0,30 г; К_н = 1,15.

Выход хитинсодержащего комплекса из биомассы, полученной из 100 мл глубинной культуры 1,4 г.

Содержание глюкозамина 0,95 мг/100 мг комплекса.

Примеры 19-22, иллюстрирующие получение продуктов микробиологического синтеза при культивировании Aspergillus awamori F-122, представлены в табл. 3.

Использование: в микробиологической промышленности при получении пектолитических или целлюлолитических ферментов, липидов и хитинсодержащих комплексов. Сущность применения: состоит в том, что посевной материал мицелиальных грибов - продуцентов пектолитических или целлюлолитических ферментов активируют монохроматическим светом длиной волны λ = 530 нм и мощностью светового потока 2,05-3,50 Вт/м². Готовят стерильную питательную среду с использованием пермеата со стадии ультрафильтрации культуральной жидкости, взятым в количестве из расчета 20 - 28 ед. пектолитической активности на 1 г сухих веществ при приготовлении среды для культивирования продуцентов пектолитических ферментов или 4,7 - 7,1 ед. целлобиогидролазной активности на 1 г сухих веществ при приготовлении среды для культивирования продуцентов целлюлолитических ферментов. В питательную среду вводят 0,01 - 0,15 мас.% лимпидов в качестве пеногасителя, выделенных из биомассы мицелиальных грибов. Культивируют продуцент при аэрации стерильным воздухом с последующим выделением пектолитических или целлюлолитических ферментов из культуральной жидкости, а биомассу экстрагируют полярными или неполярными растворителями или их смесями с последующим концентрированием экстракта с целью получения липидов. Твердый остаток промывают водой или растворами неорганических веществ, выбранных из группы солей, кислот, щелочей, и выделяют хитинсодержащий комплекс. 2 з.п.ф-лы, 3 табл.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКТОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА, включающий активацию посевного материала мицелиальных грибов - продуцентов пектолитических или целлюлолитических ферментов, приготовление стерильной питательной среды, гидролиз в присутствии гидролизующего агента, введение минеральных солей и пеногасителя, засев и культивирование продуцента при аэрации стерильным воздухом, фильтрацию культуральной жидкости, отделение биомассы и выделение ферментов, отличающийся тем, что активацию посевного материала проводят облучением монохроматическим светом с длиной волны λ_max= 530 нм при мощности светового потока 2,05 - 3,50 вт/м², в качестве пеногасителя используют липиды, выделенные из биомассы продуцентов пектолитических или целлюлолитических ферментов, в количестве 0,01 - 0,15 мас.%, в качестве гидролизующего агента используют пермеат, образующийся на стадии ультрафильтрации, взятый в количестве из расчета 20 - 28 единиц пектолитической активности на 1 г растительных компонентов при приготовлении среды для культивирования продуцентов пектолитических ферментов или 4,7 - 7,1 единиц целлобиогидролазной активности на 1 г растительных компонентов при приготовлении среды для культивирования продуцентов целлюлолитических ферментов, причем в пермеат предварительно вводят в качестве стабилизаторов ферментов CaCl₂ или MnSO₄ в количестве 0,020 - 0,025 мас.%, а из биомассы выделяют липиды и хитинсодержащий комплекс. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выделение липидов проводят экстракцией биомассы полярными и неполярными растворителями или их смесями с последующим концентрированием экстракта. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выделение хитинсодержащего комплекса проводят после выделения липидов промывкой твердого остатка биомассы водой или растворами неорганических веществ, выбранных из групп кислот, солей, щелочей.