СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ПЛАЗМИНОГЕНА И ИНГИБИТОРОВ ПЛАЗМИНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/68 A61K38/03 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в диагностике и контроле лечения сердечно-сосудистых, хирургических, гематологических и других заболеваний, при которых в крови изменяется содержание белков системы фибринолиза. Уровень этих белков характеризует степень тяжести заболевания, поэтому актуальным является удобный способ их определения в плазме крови больных. Для определения используя биохимические методы, основанные, в частности, на реакции взаимодействия этих белков с хромогенными пептидными субстратами, в результате которого происходит гидролиз субстрата и образуется окрашенное вещество. Известен целый ряд синтетических пептидных субстратов, пригодных для определения активного одного из компонентов системы фибринолиза - фермента плазмина, на основе которого определяют содержание плазминогена и ингибиторов плазмина [1,2]. В качестве ближайшего аналога рассмотрим метод определения данной активности с помощью трипептида H-D-Val-Leu-Lys-pNa•2HCl. [3] Этот субстрат (выпускаемый фирмой "Kabi", Швеция) получил самое широкое распространение и применяется для определения содержания плазминогена в плазме крови после его активации в плазмин с помощью стрептокиназы.

Определение проводится следующим способом: К 0.2 мл исследуемой плазмы крови добавляют 1 мл стрептокиназы, инкубируют 5 минут при 37^oC, добавляют 100 мкл 3 мМ раствора субстрата и либо определяют прирост оптической плотности за 1 минуту спектрофотометрически при 405 нм, либо после двухминутной инкубации пробы при 37^oC реакцию останавливают добавлением 0.5 мл 20% уксусной кислоты, после чего определяют оптическую плотность раствора при 405 нм. Содержание плазминогена выражают в % и определяют по калибровочной кривой, построенной по разведению стандартной плазмы. Указанный субстрат также применяют для определения ингибиторов плазмина в плазме крови.

Синтез пептида H-D-Val-Leu-Lys-pNa•2HCl осуществляют методами классической пептидной химии. Он представляет собой трудоемкий многостадийный процесс, включающий (исходя из свободных аминокислот в зависимости от схемы) 10-12 стадий [4].

Задача. Разработать способ определения активности плазминогена и ингибиторов плазмина с помощью хромогенного субстрата, легко доступного для синтеза. Задачу решают путем использования в качестве хромогенного пептидного субстрата вещество For-Ala-Phe-Lys-pNa•HBr, "где For-формильная группировка, Ala-аланин, Phe-фенилаланин, Lys-лизин, pNa-п-нитроанилин, HBr бромистоводородная кислота".

Способ получения For-Ala-Phe-Lys-pNa•HBr значительно проще и включает всего 7 стадий, причем две из них представляют собой ферментативные реакции, протекающие практически с количественным выходом [5]. Этот же субстрат может быть использован для определения количества ингибиторов плазмина в плазме крови.

Способ в общем виде
Метод определения плазминогена повторяет существующий метод и отличается только использованием в качестве субстрата плазмина вещества, отвечающего химической формуле For-Ala-Phe-Lys-pNa•HBr.

К 0.2 мл исследуемой плазмы крови добавляют 1 мл стрептокиназы, инкубируют 5 мин при 37^oC, добавляют 100 мкл 3 мМ раствора субстрата For-Ala-Phe-Lys-pNa•HBr, инкубируют 2 мин при 37^oC, останавливают реакцию добавлением 0.5 мл 20% уксусной кислоты и определяют оптическую плотность раствора при 405 нм. Содержание плазминогена выражают в процентах и определяют по калибровочной кривой, построенной по разведению стандартной плазмы.

Способ иллюстрируется следующими примерами
Пример 1, (контроль к примеру 2). Определение содержания плазминогена в пуле плазмы 10 здоровых доноров с помощью набора реактивов фирмы Kabi, (Швеция).

К 0.2 мл исследуемой плазмы крови добавляют 1 мл стрептокиназы, инкубируют 5 минут при 37^oC, добавляют 100 мкл 3 мМ раствора субстрата D-Val-Leu-Lys-pNa•HCl, инкубируют 2 мин при 37^oC, останавливают реакцию добавлением 0.5 мл 20% уксусной кислоты. Оптическая плотность раствора при 405 нм составила 0.09 ΔA/мин и была принята за 100%.

Пример 2. Определение содержания плазминогена в плазме крови 10 практически здоровых мужчин с помощью предложенного нами субстрата For-Ala-Phe-Lys-pNa•HBr.

Определение проводят как в примере 1, но используют раствор субстрата For-Ala-Phe-Lys-pNa•HBr. Оптическая плотность раствора при 405 нм составила 0.089 ΔA/мин, что соответствует 98.9% плазминогена.

Примеры 3. Определение содержания плазминогена в крови больного, в анамнезе инфаркт миокарда, сопровождавшийся проведением тромболитической терапии с помощью субстрата For-Ala-Phe-Lys- pNa•HBr.

Определение проводят как в примере 1, но используют раствор субстрата For-Ala-Phe-Lys-pNa•HBr. Оптическая плотность раствора при 405 нм составила 0.046 ΔA/мин, что соответствует 51.1% плазминогена.

Пример 4. (Контроль к примеру 5). Определение количества ингибиторов плазмина в стандартной плазме с помощью набора реактивов фирмы Kabi, (Швеция).

Определение проводят как в примере 1, только первую инкубацию проводят 40 минут. Оптическая плотность раствора при 405 нм составила 0.12 ΔA/мин, что принято за 100%.

Пример 5. Определение количества ингибиторов плазмина в стандартной плазме с помощью предложенного нами субстрата For-Ala-Phe-Lys-pNa•HBr.

Определение проводят как в примере 4, но в качестве субстрата используют For-Ala-Phe-Lys-pNa•HBr. Оптическая плотность раствора при 405 нм составила 0.122 ΔA/мин, что соответствует 101.7% плазминогена.

Таким образом, из примеров 1 и 2 (для плазминогена) и примеров 4 и 5 (для ингибиторов плазмина) следует, что заявленный способ определения этих ферментов по чувствительности не уступает методу, изложенному в ближайшем аналоге. А пример 3 свидетельствует о том, что способ с применением пептида For-Ala-Phe-Lys-pNa•HBr достаточно чувствителен и пзволяет достоверно определять количество плазминогена при более низких его концентрациях в крови больных.

Литература
1. Gabriella Cs. Szabo, Marianna Pozsgay, P.Elodi, Trombosis Research, 20, 1980, 199-206.

2. Yoshio Okada, Yuko Tsuda, Noaki Teno, Keiko Wanaka, Kuniko Sasaki, Akiko Hijikata, Shosuke Okamoto, Int.J.Peptide Protein Res., 27, 1986, 79-85.

3. EP 264753.

4. Sushil K.Sharma, Francis J. Castelino, Trombosis Research, 57, 1990, 127-138.

5. Voyushina T. L. , Terent'eva E.Yu., Stepanov V.M., Biomed. Biochim. Acta, 50 1991, 209-212.

Изобретение относится к области медицины. Сущность его состоит в определении содержания в крови плазминогена и ингибиторов плазмина с использованием хромогенного субстрата химической структуры For-Аla-Phe-Lys-pNa.HBr. После активации стрептокиназой указанные белки расщепляют пептидный субстрат с образованием п-нитроанилина. Метод с использованием предложенного соединения не уступает по чувствительности известным. Изобретение расширяет арсенал способов для определения в диагностических целях содержания в плазме крови плазминогена и ингибиторов плазмина.

Способ определения содержания плазминогена и ингибиторов плазмина в плазме крови путем добавления к ней хромогенных пептидных субстратов с последующим определением степени их гидролиза, отличающийся тем, что в качестве хромогенного субстрата используют вещество, имеющее химическую структуру For-Ala-Phe-Lys-pNa.HBr, где For - формильная группировка, Ala - аланин, Phe - фенилаланин, Lys - лизин, pNa-п-нитроанилин, HBr - бромистоводородная кислота.