ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ПАРАТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 C12R1/32 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к культивированию микобактерий паратуберкулеза.

Известна плотная питательная среда Дюбо-Смита в модификации А.П. Аликаевой (Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики паратуберкулеза ГОСТ 26073-84 (СТ СЭВ 3458-81). - Москва, 1984 - с.8) для выращивания микобактерий паратуберкулеза, содержащая однозамещенный фосфорнокислый калий 1 г; двузамещенный фосфорнокислый натрий 6,25 г; сернокислый магний 0,01 г; хлористый кальций 0,0005 г; сернокислый цинк 0,0001 г; сернокислую медь 0,0001 г; лимоннокислое аммонийное железо 0,05 г; аспарагин 1 г; гидролизат казеина 80 см³; микобактин 20 см³; дистиллированную воду до 1 литра; стерильную не активированную сыворотку крупного рогатого скота (нормальную) 20%; пенициллин 50 ЕД/см³ среды.

Недостатком данной среды является длительный срок роста на ней микобактерий паратуберкулеза.

Наиболее близкой по сущности к заявляемому решению является плотная питательная среда Левенштейна-Йенсена с добавлением микобактина (Бюллетень ВИЭВ «Способы и средства диагностики и борьбы с туберкулезом, бруцеллезом и паратуберкулезом сельскохозяйственных животных». Москва, - вып.73-74. - с.73), состоящая из следующих компонентов: сернокислого магния 0,25 г; натрия лимоннокислого 0,5 г; железоаммиачных квасцов 0,025 г; калия фосфорнокислого однозамещенного - 10,0 г; аммония лимоннокислого однозамещенного 2,5 г; гликокола 5 г; спиртового экстракта M.phlei 20 мл; глицерина 2,5 мл; дистиллированной воды и картофельного экстракта до 250 мл; 16-18 яиц; 2%-ного водного раствора малахитовой зелени 18 мл.

Однако данная плотная питательная среда не позволяет получить рост микобактерий паратуберкулеза в ускоренные сроки, а приготовление микобактина является достаточно сложным технологическим процессом.

Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала питательных сред, используемых для культивирования микобактерий паратуберкулеза.

Поставленная задача решается тем, что питательная среда для культивирования микобактерий паратуберкулеза, включающая глицерин, 2%-ный водный раствор малахитовой зелени, минерально-солевую основу, яйца куриные, биологически активную добавку, согласно изобретению содержит в качестве биологически активной добавки оксидат торфа, а в качестве минерально-солевой основы - вытяжку древесной золы, при следующем соотношении компонентов:

Яйца куриные 4-5 шт 3%-ная вытяжка древесной золы 100 мл 2%-ный водный раствор малахитовой зелени 4 мл Глицерин 2,0 г Оксидат торфа 2,0 г

Приготовление среды производят следующим образом.

Берут 4-5 куриных яйца, моют щеткой с мылом и обрабатывают спиртом. Стерильным пинцетом разбивают яйца и выливают в стерильную колбу с бусами. Колбу встряхивают несколько минут после добавления каждого яйца до образования однородной массы. Добавляют 4 мл 2%-ного раствора малахитовой зелени и вводят в качестве солевой основы 100 мл вытяжки древесной золы, в которую добавлено 2,0 г глицерина. В качестве биологически-активной добавки в предлагаемую среду дополнительно вводят оксидат торфа (ТУ 88 БССР 135-88). Фильтруют через марлевый фильтр, разливают по 4-5 мл среды в пробирки и свертывают (нагревают) при температуре 85°С в течение 30 мин, в результате этого происходит денатурация белка и среда становится плотной.

С целью исследования информативности и эффективности приготовленных сред на них проводили посевы следующих субстанций: трехнедельного стандартизированного штамма M.paratuberculosis (Центрально-Любинский); изолята, полученного после посева обработанного биологического материала крупного рогатого скота и суспензии, полученной после обработки отдела толстого кишечника и лимфатических узлов крупного рогатого скота. Биоматериал обрабатывали методом А.П. Аликаевой («Практикум по ветеринарной микробиологии» под ред. Байрак В.А., Беляев В.М., Гительсон С.С и др. - Москва, 1980. - 62 с.). Культуры микобактерий для посева стандартизировали по стандарту мутности 500 млн кл/мл и засевали в пробирки со средами по 1 мл полученной суспензии.

Пример 1. Среду готовят следующим образом. 4-5 куриных яйца моют щеткой с мылом и обрабатывают спиртом. Стерильным пинцетом разбивают яйца и выливают в стерильную колбу с бусами. Колбу встряхивают несколько минут после добавления каждого яйца до образования однородной массы. Добавляют 4 мл 2%-ного раствора малахитовой зелени и вводят в качестве солевой основы 100 мл вытяжки древесной золы.

Вытяжку древесной золы готовят по следующей методике: берут 0,5 г золы, просеянной через сито, доливают до 100 мл дистиллированной водой, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем - через бумажный и автоклавируют при 1,5 атм 30 мин.

В состав вытяжки добавляют 2,0 г глицерина и 1,5 г оксидата торфа в качестве биологически активной добавки.

Среду разливают по 5 мл в пробирки и свертывают в специальном аппарате в наклонном положении при t 85°C в течение 30 минут. Вследствие свертывания в аппарате при высокой температуре происходит денатурация белка, и среда становится плотной.

Пример 2. Готовят среду в соответствии с примером 1 и добавляют 2,0 г оксидата торфа.

Пример 3. Готовят среду в соответствии с примером 1 и добавляют 2,5 г оксидата торфа

Сроки роста культур при посеве стандартизированного штамма M.paratuberculosis; изолята M.paratuberculosis, полученного из биоматериала и биоматериала, полученного от крупного рогатого скота, на средах, приготовленных в примерах 1, 2 и 3, представлены в таблице 1.

Из данных таблицы следует, что оптимальные сроки роста стандартизированного штамма M.paratuberculosis; изолята M.paratuberculosis, полученного из биоматериала и культур из биоматериала, полученного от крупного рогатого скота, получены на среде, стимулирующими ингредиентами которой являются 0,5%-ная вытяжка из древесной золы с добавлением 2,0 г оксидата торфа.

Пример 4. Среду готовят следующим образом. 4-5 куриных яйца моют щеткой с мылом и обрабатывают спиртом. Стерильным пинцетом разбивают яйца и выливают в стерильную колбу с бусами. Колбу встряхивают несколько минут после добавления каждого яйца до образования однородной массы. Добавляют 4 мл 2%-ного раствора малахитовой зелени и вводят в качестве солевой основы 100 мл вытяжки древесной золы.

Вытяжку древесной золы готовят по следующей методике: берут 1,5 г золы, просеянной через сито, доливают до 100 мл дистиллированной водой, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем - через бумажный и автоклавируют при 1,5 атм 30 мин.

В состав вытяжки добавляют 2,0 г глицерина и 1,5 г оксидата торфа в качестве биологически активной добавки.

Среду разливают по 5 мл в пробирки и свертывают в специальном аппарате в наклонном положении при t 85°C в течение 30 минут. Вследствие свертывания в аппарате при высокой температуре происходит денатурация белка, и среда становится плотной.

Пример 5. Среду готовят в соответствии с примером 4 и добавляют 2,0 г оксидата торфа.

Пример 6. Среду готовят в соответствии с примером 4 и добавляют 2,5 г оксидата торфа.

Результаты испытания питательных сред, приготовленных в примерах 4, 5 и 6, представлены в таблице 2.

Проведенные исследования показали, что первичный рост стандартизированного штамма M.paratuberculosis; изолята M.paratuberculosis, полученного из биоматериала и культур из биоматериала, полученного от крупного рогатого скота, в более короткие сроки получен на среде, стимулирующими ингредиентами которой являются 1,5%-ная вытяжка из древесной золы с добавлением 2,0 г оксидата торфа.

Пример 7. Среду готовят следующим образом. 4-5 куриных яйца моют щеткой с мылом и обрабатывают спиртом. Стерильным пинцетом разбивают яйца и выливают в стерильную колбу с бусами. Колбу встряхивают несколько минут после добавления каждого яйца до образования однородной массы. Добавляют 4 мл 2%-ного раствора малахитовой зелени и вводят в качестве солевой основы 100 мл вытяжки древесной золы.

Вытяжку древесной золы готовят по следующей методике: берут 3,0 г золы, просеянной через сито, доливают до 100 мл дистиллированной водой, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем - через бумажный и автоклавируют при 1,5 атм 30 мин.

В состав вытяжки добавляют 2,0 г глицерина и 1,5 г оксидата торфа в качестве биологически активной добавки.

Среду разливают по 5 мл в пробирки и свертывают в специальном аппарате в наклонном положении при t 85°C в течение 30 минут. Вследствие свертывания в аппарате при высокой температуре происходит денатурация белка, и среда становится плотной.

Пример 8. Среду готовят в соответствии с примером 7 и добавляют 2,0 г оксидата торфа.

Пример 9. Среду готовят в соответствии с примером 7 и добавляют 2,5 г оксидата торфа.

Результаты испытания питательных сред, приготовленных в примерах 7, 8 и 9, представлены в таблице 3.

Из полученных данных следует, что сокращение сроков появления первичного и интенсивного роста микобактерий паратуберкулеза происходит при использовании опытной среды следующего состава: яйца куриные 4-5 шт., 100 мл 3%-ной вытяжки древесной золы, 4 мл 2%-ного водного раствора малахитовой зелени, 2,0 г глицерина, 2,0 г оксидата торфа (пример 8).

С целью установления диагностической информативности и эффективности предлагаемой среды мы провели ее сравнительный анализ с известной средой Левенштейна-Йенсена с микобактином. Результаты исследования представлены в таблице 4.

На основании проведенных исследований установлено, что предлагаемая питательная среда, в состав которой входит минеральный комплекс - вытяжка из золы древесины березы - и биологическая добавка в виде оксидата торфа, позволяет стимулировать рост микобактерий паратуберкулеза при посеве стандартизированного штамма M.paratuberculosis; изолята и биологического материала (лимфатические узлы и отдел толстого кишечника).

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования микобактерий паратуберкулеза. Питательная среда содержит куриные яйца, 3%-ную вытяжку древесной золы, 2%-ный водный раствор малахитовой зелени и оксидат торфа. Изобретение позволяет сократить срок выявления микобактерий паратуберкулеза. 4 табл.

Плотная питательная среда для культивирования микобактерий паратуберкулеза, включающая глицерин, 2%-ный водный раствор малахитовой зелени, минерально-солевую основу, яйца куриные, биологически активную добавку, отличающаяся тем, что содержит в качестве биологически активной добавки оксидат торфа, а в качестве минерально-солевой основы - вытяжку древесной золы при следующем соотношении компонентов:
Яйца куриные, шт 4-5 3%-ная Вытяжка древесной золы, мл 100 2%-ный Водный раствор малахитовой зелени, мл 4 Глицерин, г 2,0 Оксидат торфа, г 2,0