МЯСОПЕПТОННЫЙ АГАРОВЫЙ ГЕЛЬ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2008 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к культивированию микобактерий туберкулеза на жидких питательных средах.

Известен способ посева микобактерий («Диагностика и профилактика инфекционных болезней сельскохозяйственных животных», Сб. науч. тр., Воронежский сельскохозяйственный институт, Воронеж, 1990, С.35-38), при котором культуры штаммов микобактерий вносят в виде суспензий на физиологическом растворе в жидкую среду с парафиновыми дисками. Недостатком данного метода является техническая сложность при осуществлении посева микобактерий и необходимость помещения дисков под микроскоп с целью обнаружения колоний микобактерий.

Наиболее близким по сущности заявляемого решения является способ культивирования микобактерий туберкулеза с использованием дисков мясопептонного агарового геля диаметром 3 см, которые помещают на поверхность питательной среды Гельберга в чашках Петри (Проблемы туберкулеза, 1985, №7, с.62-64). Однако этот способ имеет тот недостаток, что рост микобактерий на агаровом геле можно обнаружить только под микроскопом.

Технической задачей заявляемого изобретения является изменение формы носителя из мясопептонного агарового геля и изменение состава последнего для получения ускоренного роста культур микобактерий на жидкой питательной среде.

Поставленная техническая задача решается тем, что мясопептонный агаровый гель для культивирования микобактерий туберкулеза согласно изобретению дополнительно содержит глюкозу и глицерин в г на 100 г мясопептонного агарового геля:

глюкоза1,0-1,2глицерин2,0-2,2

Поставленная техническая задача решается также тем, что в способе культивирования микобактерий туберкулеза, предусматривающем посев культуры микобактерий на поверхность мясопептонного агарового геля, помещенного в жидкую питательную среду, согласно изобретению посев культуры микобактерий осуществляют на поверхность столбика, приготовленного из мясопептонного агарового геля по п.1 формулы, высотой 8,0-8,2 см и диаметром 1,0-1,2 см, который помещают в жидкую питательную среду таким образом, чтобы поверхность столбика была выше уровня среды на 2-3 мм.

В данном способе нами использована жидкая питательная среда для культивирования патогенных штаммов микобактерий туберкулеза (см. патент РФ №2300559 от 04.07.2005). Кроме того, в предлагаемом способе для выращивания микобактерий туберкулеза используют также жидкие питательные среды Сотона, Моделя (Кассич Ю.Я., Борзяк А.Т., Кочмарский А.Ф. Туберкулез животных и меры борьбы с ним. - Киев: Урожай, 1990. - 304 с.).

Диагностическую информативность представленного способа проверяли путем культивирования на поверхности мясопептонного агарового геля с различным содержанием глюкозы и глицерина патогенных и непатогенных штаммов культур микобактерий туберкулеза: M.bovis (шт.8, ВИЭВ), M.tuberculosis (шт.H37Rv), M.avium (шт.780, ВИЭВ) и M.smegmatis (культура ГНУ ИЭВСиДВ). Указанные штаммы являются типовыми, эталонными. M.bovis (шт.8, ВИЭВ) и M.avium (шт.780, ВИЭВ) получены из музея лаборатории туберкулеза ВИЭВ. M.tuberculosis (шт.H37Rv) - из музея лаборатории туберкулеза НИВИ Нечерноземной зоны г.Нижний Новгород. M.smegmatis - полевой штамм, выделенный из биологического материала (лимфатические узлы) крупного рогатого скота, принадлежащего ЗАО «Суздальское» Новосибирской области, в лаборатории туберкулеза ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии. Культуры идентифицированы в соответствии с указаниями «Наставления по диагностике туберкулеза животных: Утв. Департаментом ветеринарии РФ 18.11.02. - М., 2002».

Осуществление способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Готовили мясопептонный гель с добавлением в его состав 0,5-0,7 г глюкозы и 1,5-1,7 мл глицерина. Осуществляли посев штаммов культур микобактерий M.bovis (шт.8, ВИЭВ), M.tuberculosis (шт.H37Rv), M.avium (шт.780, ВИЭВ) и M.smegmatis (культура ГНУ ИЭВСиДВ) на поверхность данного геля.

Пример 2. Готовили мясопептонный гель с добавлением в его состав 1,0-1,2 глюкозы и 2,0-2,2 мл глицерина. Осуществляли посев штаммов культур микобактерий M.bovis (шт.8, ВИЭВ), M.tuberculosis (шт.H37Rv), M.avium (шт.780, ВИЭВ) и M.smegmatis (культура ГНУ ИЭВСиДВ) на поверхность данного геля.

Пример 3. Готовили мясопептонный гель с добавлением в его состав 1,5-1,7 г глюкозы и 2,5-2,7 мл глицерина. Осуществляли посев штаммов культур микобактерий M.bovis (шт.8, ВИЭВ), M.tuberculosis (шт.H37Rv), M.avium (шт.780, ВИЭВ) и M.smegmatis (культура ГНУ ИЭВСиДВ) на поверхность данного геля.

Сроки роста штаммов культур микобактерий туберкулеза на мясопептонном агаровом геле с добавлением в его состав различных соотношений глюкозы и глицерина представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Сроки появления роста штаммов культур микобактерий M.bovis (шт.8, ВИЭВ), M.tuberculosis (шт.H37Rv), M.avium (шт.780, ВИЭВ) и M.smegmatis (культура ГНУ ИЭВСиДВ) на мясопептонном агаровом геле с добавлением в его состав различных соотношений глюкозы и глицерина

Культуры микобактерийСпособ посеваДиски из мясопептонного агарового геляПример 1 (мясопептонный агаровый гель с добавлением 0,5-0,7 г глюкозы и 1,5-1,7 мл глицерина)Пример 2 (мясопептонный агаровый гель с добавлением 1,0-1,2 г глюкозы и 2,0-2,2 мл глицерина)Пример 1 (мясопептонный агаровый гель с добавлением 1,5-1,7 г глюкозы и 2,5-2,7 мл глицерина)Рост (сутки) появ.интен.появ.интен.появ.интен.появ.интен.M.bovis (шт.8, ВИЭВ)1116121410121214M.tuberculosis (шт.H37Rv)8126104859M.avium (шт.780, ВИЭВ)81261048610M.smegmatis (культура ГНУ ИЭВСиДВ)22222222

Приготовление столбиков из мясопептонного агарового геля производили следующим образом: расплавленный и профильтрованный мясопептонный агаровый гель разливали в стерильные стаканы по 250 мл, вносили дополнительные компоненты глюкозу и глицерин и специальным стерильным цилиндром вырезали столбики высотой 8,0-8,2 см и диаметром 1,0-1,2 см с последующим помещением их в пробирки с жидкой средой так, чтобы поверхность столбика была выше уровня среды на 2-3 мм.

Для контроля использовали способ посева культур на диски из мясопептонного агарового геля.

Для подтверждения оптимальных размеров столбиков, на которые осуществляется посев культур микобактерий, проводили следующие исследования.

Пример 4. Посев штаммов культур микобактерий M.bovis (шт.8, ВИЭВ), M.tuberculosis (шт.H37Rv), M.avium (шт.780, ВИЭВ) и M.smegmatis (культура ГНУ ИЭВСиДВ) осуществляли на столбик из мясопептонного глюкозоглицеринового агарового геля высотой 7,5-7,7 см и диаметром 0,5-0,7 см, поверхность над средой составляет 0,5-1,0 мм.

Способ 5. Посев штаммов культур микобактерий M.bovis (шт.8, ВИЭВ), M.tuberculosis (шт.H37Rv), M.avium (шт.780, ВИЭВ) и M.smegmatis (культура ГПУ ИЭВСиДВ) осуществляли на столбик из мясопептонного глюкозоглицеринового агарового геля высотой 8,0-8,2 см и диаметром 1,0-1,2 см, поверхность над средой составляет 2,0-3,0 мм.

Способ 6. Посев штаммов культур микобактерий M.bovis (шт.8, ВИЭВ), M.tuberculosis (шт.H37Rv), M.avium (шт.780, ВИЭВ) и M.smegmatis (культура ГНУ ИЭВСиДВ) осуществляли на столбик из мясопептонного глюкозоглицеринового агарового геля высотой 8,5-8,7 см и диаметром 1,5-1,7 см, поверхность над средой составляет 3,5-4,0 мм.

Результаты появления роста штаммов культур микобактерий M.bovis (шт.8, ВИЭВ), M.tuberculosis (шт.H37Rv), M.avium (шт.780, ВИЭВ) и M.smegmatis (культура ГНУ ИЭВСиДВ) на столбиках из мясопептонного глюкозоглицеринового агарового геля различной высоты, диаметра и уровня над поверхностью среды, представлены в таблице 2.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что замена дисков из мясопептонного агарового геля на столбики позволяет упростить технику посева микобактерий при проведении бактериологической диагностики на туберкулез. Кроме того, использование в составе столбиков из мясопептонного агарового геля, 1,0-1,2 г глюкозы и 2,0-2,2 мл глицерина позволяет ускорить получение бактериальной массы микобактерий.

Также из полученных данных следует, что сокращение сроков появления первичного и интенсивного роста штаммов культур микобактерий туберкулеза M.bovis (шт.8, ВИЭВ), M.tuberculosis (шт.H37Rv), M.avium (шт.780, ВИЭВ) и M.smegmatis (культура ГНУ ИЭВСиДВ) происходит при использовании для посева микобактерий столбиков из мясопептонного глюкозоглицеринового агарового геля высотой 8,0-8,2 см и диаметром 1,0-1,2 см, возвышающихся над поверхностью среды на 2-3 мм.

Предлагаемый способ культивирования микобактерий туберкулеза позволяет в более ранние сроки поставить диагноз на туберкулез, что подтверждает его диагностическую информативность.

Таблица 2 - Сроки появления роста штаммов культур микобактерий M.bovis (шт.8, ВИЭВ), M.tuberculosis (шт.H37Rv), M.avium (шт.780, ВИЭВ) и M.smegmatis (культура ГНУ ИЭВСиДВ) на столбиках из мясопептонного глюкозоглицеринового агарового геля различной высоты, диаметра и уровня над поверхностью среды.

Культуры микобактерийСпособ посеваДиски из мясопептонного агарового геляПример 4 (столбики из мясопептонного глюкозоглицеринового агарового геля высотой 7,5-7,7 см и диаметром 0,5-0,7 см, над средой 0,5-1,0 мм)Пример 5 (столбики из мясопептонного глюкозоглицеринового агарового геля высотой 8,0-8,2 см и диаметром 1,0-1,2 см, над средой 2,0-3,0 мм)Пример 6 (столбики из мясопептонного глюкозоглицеринового агарового геля высотой 8,5-8,7 см и диаметром 1,5-1,7 см, над средой 3,5-4,0 мм)Рост (сутки) появ.интен.появ.интен.появ.интен.появ.интен.M.bovis (шт.8, ВИЭВ)1116121410121214M.tuberculosis (шт.H37Rv)8126104859M.avium (шт.780, ВИЭВ)81261048610M.smegmatis (культура ГНУ ИЭВСиДВ)22222222

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к культивированию микобактерий туберкулеза на жидких питательных средах. Посев культуры микобактерий осуществляют на поверхность столбика, приготовленного из мясопептонного агарового геля, дополнительно содержащего на 100 г геля 1,0-1,2 г глюкозы и 2,0-2,2 мл глицерина, высотой 8,0-8,2 см и диаметром 1,0-1,2 см, который выступает над поверхностью жидкой питательной среды на 2-3 мм. Для определения диагностической информативности данного способа культивирования микобактерий осуществляют посев эталонных штаммов культур микобактерий туберкулеза: M.bovis (шт.8, ВИЭВ); M.tuberculosis (шт.H37Rv),M.avium (шт.780, ВИЭВ) M.smegmatis (культуры ИЭВСиДВ). Изобретение позволяет ускорить на 2-6 суток первичный и интенсивный рост микобактерий туберкулеза в сравнении с другими способами посева и способствует при этом максимальному накоплению бактериальной массы культур микобактерий туберкулеза, что свидетельствует о его диагностической информативности. 2 н.п. ф-лы, 2 табл.

1. Мясопептонный агаровый гель для культивирования микобактерий туберкулеза, отличающийся тем, что он дополнительно содержит глюкозу и глицерин, в г на 100 г мясопептонного агарового геля:

глюкоза1,0-1,2глицерин2,0-2,2