СРЕДА ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ Российский патент 2009 года по МПК C12Q1/14 C12N1/20 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к дифференциальной диагностике энтеробактерий, и может быть использовано для ускоренной индикации и дифференциации энтеробактерий, выделенных из биологического материала животных и птиц.

Известна питательная среда Левина для выращивания сальмонелл, эшерихий, протеев, стафилококков и грибов рода Candida, содержащая пептон, агар-агар, NaCl, лактозу, двуосновной фосфат калия, индикаторы эозин желтый и метиловый синий - готовится на мясной воде.

Однако использование этой питательной среды усложнено тем, что она не подлежит хранению в готовом виде, кроме того, она позволяет дифференцировать лишь три рода представителей семейства энтеробактерий.

Наиболее близкой по сущности заявляемому решению является известная политропная полужидкая питательная среда - ГШПС (Лабораторное дело, 1979, №8, стр.492, - Китченко А.В. с соавт.), предназначенная для ускоренной индикации и родовой дифференциации представителей энтеробактерий - сальмонелл, эшерихий, цитробактеров, клебсиелл, протеев, гафний. Состав среды: NaCl ч.д.а. 4,0; фосфата натрия х.ч. 0,5; сернокислого аммония ч.д.а. 1,0; сернокислого калия ч. 2,0; сернокислого магния ч.д.а. 0,5; углекислого натрия ч.д.а. 0,2; лактозы 20,0; маннита 1,0; пептона 20,0; нейтрального красного 0,04; бромтимолового синего 0,02; агар-агара 2,5-3,5; воды дистиллированной 1000,0.

Однако эта среда требует большого количества компонентов, что делает ее более дорогой и сложной в приготовлении.

Задача данного изобретения - расширение арсенала питательных сред, используемых в бактериологической диагностике.

Поставленная задача решается тем, что известная среда для дифференциальной диагностики энтеробактерий, включающая агар-агар, лактозу, маннит, пептон, NaCl, нейтральный красный, бромтимоловый синий и минерально-солевую основу (фосфат натрия, сернокислый аммоний, сернокислый калий, сернокислый магний, углекислый натрий), согласно изобретению в качестве минерально-солевой основы содержит вытяжку древесной золы березы, выдержанную в течение 3-х суток, при следующем соотношении компонентов:

0,5-%-ная вытяжка древесной золы березы,   выдержанная в течение 3-х суток 1000,0 мл лактоза 20,0 г маннит 1,0 г пептон 20,0 г NaCl 4,0 г агар-агар 2,5-3,5 г нейтральный красный 0,04 г бромтимоловый синий 0,02 г

Изобретение осуществляется следующим образом.

В качестве заменителя набора солей, применяемых в составе среды, использована древесная зола, полученная из березы, в составе ее содержатся калий, натрий, магний, железо, марганец, медь, цинк.

Приготовление среды.

Экспериментальную политропную полужидкую питательную среду - ЭПППС - готовят на основе вытяжки древесной золы березы, выдержанной в течение 3-х суток, заменяя тем самым минерально-солевую основу среды-прототипа, при этом содержание остальных компонентов остается неизменным.

Зола древесины березы (заявка на патент №2000126439 от 2000 г.) имеет сложный минеральный комплекс - в нем содержатся калий, натрий, магний, железо, марганец, медь, цинк.

Спектральный анализ древесины березы и вытяжек из ее золы в зависимости от времени года, а также до и после автоклавирования, проведены в лаборатории биохимии доктором с.-х. наук Скуковским Б.А. (ГНУ СибНИПТИЖ СО Россельхозакадемии).

Состав макро- и микроэлементов золы древесины березы не зависит от того, в какое время года она была получена. Доказано, что при выдержке от 1 до 2 дней все полученные концентрации содержат меньшее количество макро- и микроэлементов, чем при выдержке от 3 до 4 дней. Кроме того, данный компонент является достаточно дешевым и доступным.

Сначала готовят 0,5%-ную вытяжку древесной золы березы, выдержанную в течение 3-х суток (1000,0 мл) - для этого берут 6,0 г древесной золы березы, просеянной через сито, и доливают до 1200,0 мл дистиллированной водой, выдерживают 3 суток, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем - через бумажный, автоклавируют при 1,5 атм 30 мин. Для дальнейшей работы используют 1000,0 мл готовой вытяжки.

2,5-3,0 г агар-агара предварительно заливают небольшим количеством 0,5%-ной вытяжки древесной золы березы, выдержанной в течение 3-х суток (30,0-50,0 мл) и оставляют на 1-2 часа.

Остальную вытяжку подщелачивают 1%-ным раствором NaOH до рН 7,0-7,2.

20,0 г пептона размешивают стеклянной палочкой в небольшом количестве 0,5%-ной вытяжки (50,0-100,0 мл).

0,04 г нейтрального красного растворяют в 3 мл дистиллированной воды, подогревая в водяной бане (до полного растворения).

0,02 г бромтимолового синего растворяют в 0,5 мл спирта.

Все подготовленные компоненты вносят в колбу с оставшейся 0,5%-ной вытяжкой древесной золы березы, добавляют 1,0 г маннита, 20,0 г лактозы, 4,0 г NaCl и кипятят 5-7 минут (до полного растворения агар-агара), фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 40°С и доводят рН среды до 7,0-7,2. Готовую среду разливают в пробирки по 3 мл и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 20 минут. Среда имеет темно-коричневый цвет (плохо заваренного чая).

Чистые культуры энтеробактерий (музейные штаммы), а также выделенные культуры от больных животных и птиц (подозрительные колонии), выращенные на простых и элективных питательных средах, засевают уколом на испытуемую экспериментальную среду - ЭПППС и контрольную политропную полужидкую питательную среду - ПППС (Лабораторное дело, 1979, №8, стр.492, Китченко А.В с соавт.). Посевы инкубируют при температуре +37°С, просматривают через сутки и учитывают результаты по изменению цвета питательной среды в зависимости от роста различных представителей семейства энтеробактерий.

Изобретение характеризуется следующими примерами его осуществления

Пример 1.

Сначала готовят 0,5%-ную вытяжку древесной золы березы, выдержанную в течение 3-х суток (1000,0 мл) - для этого берут 6,0 г древесной золы березы, просеянной через сито, и доливают до 1200,0 мл дистиллированной водой, выдерживают 3 суток, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем - через бумажный, автоклавируют при 1,5 атм 30 мин. Для дальнейшей работы используют 1000,0 мл готовой вытяжки.

Далее 2,5-3,0 г агар-агара заливают небольшим количеством 0,5%-ной вытяжки (30,0-50,0 мл) и оставляют на 1-2 часа.

Остальную вытяжку подщелачивают 1%-ным раствором NaOH до рН 7,0-7,2.

В небольшом количестве 0,5%-ной вытяжки (50,0-100,0 мл) размешивают стеклянной палочкой 20,0 г пептона.

Нейтральный красный 0,04 г растворяют в 3 мл дистиллированной воды, подогревая в водяной бане (до полного растворения).

Бромтимоловый синий 0,02 г растворяют в 0,5 мл спирта.

Все подготовленные компоненты вносят в колбу с оставшейся 0,5%-ной вытяжкой, добавляют 1,0 г маннита, 20,0 г лактозы, 4,0 г NaCl и кипятят 5-7 минут (до полного растворения агар-агара), фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 40°С и доводят рН среды до 7,0-7,2. Готовую среду разливают в пробирки по 3 мл и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 20 минут. Среда имеет темно-коричневый цвет (плохо заваренного чая). На эту среду пробно засевают уколом культуру семейства энтеробактерий (в нашем случае - сальмонеллу).

Пример 2.

Сначала готовят 1,5%-ную вытяжку древесной золы березы, выдержанную в течение 3-х суток (1000,0 мл) - для этого берут 18,0 г древесной золы березы, просеянной через сито, и доливают до 1200,0 мл дистиллированной водой, выдерживают 3 суток, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем - через бумажный, автоклавируют при 1,5 атм 30 мин. Для дальнейшей работы используют 1000,0 мл готовой вытяжки.

Далее 2,5-3,0 г агар-агара заливают небольшим количеством 1,5%-ной вытяжки (30,0-50,0 мл) и оставляют на 1-2 часа.

Остальную вытяжку подщелачивают 1%-ным раствором NaOH до рН 7,0-7,2.

В небольшом количестве 1,5%-ной вытяжки (50,0-100,0 мл) размешивают стеклянной палочкой 20,0 г пептона.

Нейтральный красный 0,04 г растворяют в 3 мл дистиллированной воды, подогревая в водяной бане (до полного растворения).

Бромтимоловый синий 0,02 г растворяют в 0,5 мл спирта.

Все подготовленные компоненты вносят в колбу с оставшейся 1,5%-ной вытяжкой, добавляют 1,0 г маннита, 20,0 г лактозы, 4,0 г NaCl и кипятят 5-7 минут (до полного растворения агар-агара), фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 40°С и доводят рН среды до 7,0-7,2. Готовую среду разливают в пробирки по 3 мл и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 20 минут. Среда имеет темно-коричневый цвет (плохо заваренного чая). На эту среду пробно засевают уколом культуру семейства энтеробактерий (в нашем случае - сальмонеллу).

Пример 3.

Сначала готовят 3,0%-ную вытяжку древесной золы березы, выдержанную в течение 3-х суток (1000,0 мл) - для этого берут 36,0 г древесной золы березы, просеянной через сито, и доливают до 1200,0 мл дистиллированной водой, выдерживают 3 суток, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем - через бумажный, автоклавируют при 1,5 атм 30 мин. Для дальнейшей работы используют 1000,0 мл готовой вытяжки.

Далее 2,5-3,0 г агар-агара заливают небольшим количеством 3,0%-ной вытяжки (30,0-50,0 мл) и оставляют на 1-2 часа.

Остальную вытяжку подщелачивают 1%-ным раствором NaOH до рН 7,0-7,2.

В небольшом количестве 3,0%-ной вытяжки (50,0-100,0 мл) размешивают стеклянной палочкой 20,0 г пептона.

Нейтральный красный 0,04 г растворяют в 3 мл дистиллированной воды, подогревая в водяной бане (до полного растворения).

Бромтимоловый синий 0,02 г растворяют в 0,5 мл спирта.

Все подготовленные компоненты вносят в колбу с оставшейся 3,0%-ной вытяжкой, добавляют 1,0 г маннита, 20,0 г лактозы, 4,0 г NaCl и кипятят 5-7 минут (до полного растворения агар-агара), фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 40°С и доводят рН среды до 7,0-7,2. Готовую среду разливают в пробирки по 3 мл и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 20 минут. Среда имеет темно-коричневый цвет (плохо заваренного чая). На эту среду пробно засевают уколом культуру семейства энтеробактерий (в нашем случае - сальмонеллу).

Результаты испытания питательных сред, приготовленных в примерах 1, 2 и 3, представлены в таблице 1.

Музейные штаммы энтеробактерий Таблица 1 ИЗМЕНЕНИЕ ЦВЕТА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ Пример 1
Среда на 0,5%-ной вытяжке древесной золы березы, выдержанной в течение 3-х суток Пример 2
Среда на 1,5%-ной вытяжке древесной золы березы, выдержанной в течение 3-х суток Пример 3
Среда на 3,0%-ной вытяжке древесной золы березы, выдержанной в течение 3-х суток Контроль (ПППС) Salmonella лимонно-зеленый желто-зеленый оранжево-зеленый лимонно-зеленый

Сравнивая результаты испытания питательных сред, приготовленных в примерах 1, 2 и 3, можно констатировать, что экспериментальная среда, приготовленная на основе 0,5%-ной вытяжки древесной золы березы, выдержанной в течение 3-х суток (пример 1), совпадает по изменению цвета среды с контролем, что обусловливает ее дальнейшее применение.

Далее проводят испытание экспериментальной политропной полужидкой питательной среды - ЭПППС, приготовленной на основе 0,5%-ной вытяжки древесной золы березы, выдержанной в течение 3-х суток, для выращивания всех штаммов энтеробактерий. Для контроля используют среду - ПППС (Лабораторное дело, 1979, №8, стр.492, Китченко А.В с соавт.).

Результаты испытания экспериментальной политропной полужидкой питательной среды - ЭПППС, приготовленной на основе 0,5%-ной вытяжки древесной золы березы, выдержанной в течение 3-х суток, представлены в таблице 2.

Таблица 2 Музейные штаммы энтеробактерий ИЗМЕНЕНИЕ ЦВЕТА 1 ШТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ЭПППС ПППС (контроль) Salmonella лимонно-зеленый лимонно-зеленый Е.coli малиново-красный малиново-красный Citrobacter оранжево-красный оранжево-красный Klebsiella не изменяется или имеет красный оттенок не изменяется или имеет красный оттенок Proteus грязно-зеленый грязно-зеленый Hafhia красный красный

Сравнивая результаты испытания экспериментальной среды с контрольной, можно констатировать, что экспериментальная среда, приготовленная на основе 0,5%-ной вытяжки древесной золы березы, выдержанной в течение 3-х суток, равноценна контрольной, что дает основание для ее использования в практике.

Таким образом, введение в среду для дифференциальной диагностики энтеробактерий минерально-солевой основы в виде 0,5%-ной вытяжки древесной золы березы, выдержанной в течение 3-х суток, значительно сокращает количество компонентов, упрощает ее приготовление, удешевляет и сокращает сроки диагностических исследований.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для ускоренной индикации и дифференциации энтеробактерий. Питательная среда содержит агар-агар, лактозу, маннит, пептон, NaCl, нейтральный красный, бромтимоловый синий и 0,5%-ную вытяжку древесной золы березы, выдержанную в течение 3-х суток. Изобретение позволяет расширить арсенал питательных сред. 2 табл.

Среда для дифференциальной диагностики энтеробактерий, включающая агар-агар, лактозу, маннит, пептон, NaCl, нейтральный красный, бромтимоловый синий и минерально-солевую основу, отличающаяся тем, что в качестве минерально-солевой основы содержит вытяжку древесной золы березы, выдержанную в течение 3-х суток, при следующем соотношении компонентов:
0,5%-ная вытяжка древесной золы березы,   выдержанная в течение 3 суток 1000 мл лактоза 20,0 г маннит 1,0 г пептон 20,0 г NaCl 4,0 г агар-агар 2,5-3,5 г нейтральный красный 0,04 г бромтимоловый синий 0,02 г